羊水细胞及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2009年10月23日、申请号为"200980146959. 3"、发明名称为 "羊水细胞及其用途"的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2009/005779 的中国国家阶段申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2008年10月24日提交的美国临时申请61/108, 313的优先权，该申 请通过引用并入本文。
技术领域
[0004] 本发明涉及从羊水中获得的干细胞和祖细胞以及其分离、培养、分化方法及其用 途领域。
【背景技术】
[0005] 急性和慢性肾脏疾病是全世界的重大健康问题。患有终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD)患者的数量在发达国家和发展中国家中不断增加（Thadhani等， 1996)。如美国肾脏数据系统2005年年度数据报告所报道，超过400, 000美国人患有ESRD， 并且超过20, 000人正等待肾移植。根据对2020年的预测，预期将有超过500, 000美国人 患 ESRD。
[0006] 使用羊水作为胎儿遗传性和先天性疾病的安全可靠的筛选工具已经有许多年。在 妊娠期中，羊水的体积和组成随着发育中胎儿的生理变化而改变。已经表明羊水的分子组 成和营养物质的存在对多种肠细胞类型（例如上皮细胞和粘膜细胞）的增殖和分化具有关 键作用（Cellini 等，2006)。
[0007] 羊水与发育中胎儿的隔室（例如肺和胃肠道）之间的接触可以解释羊水环境中不 同细胞类型的存在。已经在羊水中发现了来源于所有3个胚层的成熟细胞系，包括间充质 细胞、造血细胞以及表达来自特定组织类型（例如脑、心脏和胰腺）之蛋白和多种标志物的 细胞（Hoehn 和 Salk，1982 ;Gosden，1983 ;Torricelli 等，1993)。但是还需要进一步研宄， 以根据其来源和功能对这些细胞进行完全分类（Tsangaris等，2004 ;Bossolasco等，2006 ; McLaughlin 等，2006)。
【发明内容】
[0008] 申请人已经通过随着时间跟踪其存在和研宄羊水细胞组成在妊娠期间发生的变 化对羊水总细胞群进行了表征，集中研宄了来源于3个胚层的细胞和器官的祖细胞。已经 从羊水中分离出显示出肾脏祖细胞特性的细胞亚群，包括肾小管和肾小球前体。
[0009] 本发明的一个实施方案提供了经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和0B-钙粘蛋 白阳性肾脏祖细胞群。一个实施方案提供了来源于羊水之CD24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏 祖细胞的克隆群。另一个实施方案提供了还表达E-妈粘蛋白、肾病蛋白（nephrin)、TrkA、 roGFR-a、足糖萼蛋白（podocalixin)或其组合的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞具 有被诱导分化成后肾细胞、足细胞（podocyte)、肾小球细胞、近端和远端肾小管上皮细胞、 基质源性（stromogenic)间充质细胞或系膜细胞的能力。在一个实施方案中，可以在体内 或离体诱导所述细胞群分化。
[0010] -个实施方案提供了一种组合物，其包含来源于羊水的⑶24和0B-钙粘蛋白阳性 肾脏祖细胞群、以及可药用载体和/或培养基。另一个实施方案提供了一种制备组合物的 方法，包括将来源于羊水的CD24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞或由其分化的后代与载体 (例如细胞培养基）相混合。
[0011] 另一个实施方案提供了一种产生来源于羊水之肾脏祖细胞群的方法，包括从羊水 样品中选择CD24和0B-钙粘蛋白阳性细胞。在一个实施方案中，利用抗CD24抗体和抗 0B-钙粘蛋白抗体（例如单克隆抗体、多克隆抗体或者与荧光团或磁性颗粒缀合的抗体）进 行所述选择。在另一个实施方案中，进一步对来源于羊水的CD24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏 祖细胞进行针对E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR-a、足糖萼蛋白或其组合的选择。在 一个实施方案中，所述选择通过流式细胞术进行，例如荧光活化细胞分选或高梯度磁性选 择（high gradient magnetic selection)〇
[0012] 一个实施方案提供了通过本文所述任一种方法制备的、经分离和纯化的、来源于 羊水的CD24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。
[0013]另一个实施方案提供了一种使富含来源于羊水之肾脏祖细胞的细胞群增殖的方 法，包括：从羊水样品中选择至少一个CD24和0B-钙粘蛋白阳性细胞；将所述至少一个细 胞加入到培养基中；以及使所述至少一个经选择的细胞在培养基中增殖。在一个实施方案 中，所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、PDGFR- a、足糖萼蛋白或其组合。
[0014]-个实施方案提供了一种使经分离和纯化的、来源于羊水的CD24和0B-钙粘蛋白 阳性肾脏祖细胞群分化的方法，包括使所述细胞群与至少一种分化因子接触，所述分化因 子包括但不限于ATRA、维生素3、地塞米松、BMP-7、多种不同类型的IV型胶原或其组合。
[0015] 另一个实施方案提供了一种储存经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和0B-钙粘 蛋白阳性肾脏祖细胞群的方法，包括从人对象中获得羊水样品；从所述样品中分离CD24和 0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群；以及冷冻保存来源于羊水的CD24和0B-钙粘蛋白阳性肾 脏祖细胞。
[0016] -个实施方案提供了一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象（例如 哺乳动物，包括人类）施用治疗疾病或损伤有效量的来源于羊水之CD24和0B-钙粘蛋白阳 性肾脏祖细胞或由其分化的后代。另一个实施方案提供了一种预防或治疗肾脏疾病或损伤 的方法，包括向对象施用治疗疾病或损伤有效量的从羊水中分离和纯化之c-kit阳性细胞 或者由其分化的后代。
[0017]在一个实施方案中，通过局部或全身注射施用所述细胞。在另一个实施方案中，所 述疾病包括糖尿病性肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥 漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球 肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新 月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血性肾病、基于系统性疾病的肾小球疾病、基于 血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾小球疾病、遗传性肾脏病变或移植肾小球病 变。在一个实施方案中，所述疾病是奥尔波特综合征。在一个实施方案中，所述损伤是物理 性创伤的结果（例如由于外科手术或事故或化学物质（例如过量使用化学品））。
[0018] 另一个实施方案提供了由本文所公开任一种方法生产的、经分离和纯化的、来源 于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群，其用于医学治疗。在一个实施方案中， 所述医学治疗是治疗由于损伤或疾病所致的肾脏伤害。
[0019] -个实施方案提供了由本文所公开任一种方法生产的、经分离和纯化的、来源于 羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群在制备用于治疗由于损伤或疾病所致肾脏 伤害的药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物包含生理学上可接受的载体和/或细 胞培养基。
【附图说明】
[0020] 图1显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对人羊水细胞群中3个胚层和器 官祖细胞进行表征之标志物的图。
[0021] 图2显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对人羊水细胞群中多能细胞进行 表征之标志物的图。
[0022] 图3显示用于通过RT-PCR和Western印迹分析对肾脏定向分化为之人羊水细胞 群和其衍生亚群进行表征之标志物的图。
[0023] 图4显示通过RT-PCR(A)和Western印迹⑶测定3个胚层之标志物随时间的表 达。
[0024] 图5显示⑶24+OB-钙粘蛋白+细胞群与⑶24 _OB-钙粘蛋白_选择进行比较的 RT-PCR。
[0025] 图6显示通过RT-PCR(A)和Western印迹⑶测定不同孕龄样品中肾脏祖细胞标 志物的表达。
[0026] 图7显示CD24+OB-钙粘蛋白+衍生亚群的RT-PCR。
[0027] 图8显示总羊水细胞群（A，B)和CD24+OB-钙粘蛋白+细胞群（C，D)的形态。
[0028] 图9显示通过RT-PCR⑷和Western印迹⑶测定不同孕龄样品中祖细胞标志物 的表达。
[0029] 图10描述了显示中胚层、内胚层和外胚层标志物表达的实时PCR。
[0030] 图11显示多能细胞、造血细胞和间充质细胞标志物的实时PCR。
[0031] 图12显示祖细胞标志物的实时PCR。
[0032] 图13显示肾脏祖细胞的实时PCR。
[0033] 图14显示实验中使用的人引物、产物大小和退火温度的列表。
[0034] 图15A-C :A. hAFSC细胞群的形态。在培养基中传代40次后，在亮视野（10X)中 细胞呈纤维母细胞样外观。B.注射前hAFSC的RT-PCR。无早期和成熟肾脏标志物的表达。 使用肌动蛋白作为看家基因（390bp)。C.传代38次后hAFSC的核型。细胞没有表现 出任何异常，并且具有正常的核型。
[0035] 图16A-D:A.nu/nu小鼠肾脏的组织切片（H&E)。皮层易于与髓质区分开。以箭 头标示的肾小管和肾小球呈现正常的形态（l〇X)。B.甘油-横纹肌溶解诱导ATN 3天后 nu/nu小鼠肾脏的组织切片（H&E)。肾小球仍然存在（箭头）并且没有损伤，而肾小管受损 (10X)。C.nu/nu小鼠肾脏的组织切片（PAS染色）。肾小管和肾小球是完整的，并且与受 损体相比呈现正常的形态。（D)值得注意的是管腔内管型（intraluminar cast)形成（箭 头）、刷状边缘被破坏（箭头）以及结构被破坏。
[0036] 图17A-D :A.对照（左侧未受感染的hAFSC)和经编码萤光素酶的慢病毒转导的 hAFSC (右侧）暴露于萤光素酶的底物（萤光素）中，并且经发光测定，萤光素酶在AFSC中 的体外表达持续至20pds后。B.测定在生物发光成像下检测到之最少量AFSC的体外实验。 已确定IX 105个细胞是为了检测信号而可注射的最少细胞数。C.向受损nu/nu小鼠肾脏注 射后生物发光检测AFSC的体内实验。将1. 2X106个AFSC直接注射到右肾中，用左肾作为 对照。第1个小图显示刚刚注射后萤光素酶的表达。5小时后信号非常强（第2个小图）， 24小时后也是如此（第3个小图）。信号在约第6天开始减弱（第5个小图），并且在随后 几天不明显（第6-7个小图）。如第8个小图所显示，其在第20天后再次出现。D.RT-PCR 表明与注射前（阳性对照）和未经注射（阴性对照）肾脏的细胞相比，经注射的肾脏中存 在萤光素酶序列（500bp)。用肌动蛋白作为看家基因（390bp)。E.hAFSC注射3周后 肾脏的免疫荧光染色。红色荧光（箭头）证实存在表达萤光素酶的hAFSC。细胞核用dapi 染色（20X)。
[0037] 图18A-F :A. hAFSC注射1周后肾脏的冷冻切片。在由表面标志物CM-Dil产生的红 色荧光下，细胞很明显。细胞核用DAPI染色（30X)。B. hAFSC注射3周后肾脏的双免疫荧 光染色。Aqp2的阳性表达通过红色荧光显示，而绿色荧光则显示萤光素酶的表达。对肾小管 中同时表达两种标志物的细胞进行双重染色（箭头）。细胞核用DAPI染色（30 X)。C. hAFSC 注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红色荧光显示经表面标志物CM-Dil标记的hAFSC。值 得注意的是，hAFSC定位于肾小管结构附近。绿色荧光显示hAFSC中花生凝集素（Peanut Agglutinin)的表达。细胞核用DAPI染色（40X)。D. hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染 色。红色荧光显示经表面标志物CM-Dil标记的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于肾小 管结构附近。绿色焚光显示hAFSC中双花扁豆凝集素（Dolichus Biflorus Agglutinin)的 表达（箭头）。细胞核用dapi染色（40X)。E. hAFSC注射3周后肾脏的免疫荧光染色。红 色荧光显示经表面标志物CM-Dil标记的hAFSC。值得注意的是，hAFSC定位于肾小球结构 附近。绿色焚光显示hAFSC中胶质细胞源性神经营养因子（Glial Derived Neurotrophic Factor)的表达（箭头）。细胞核用DAPI染色（40X)。EhAFSC注射3周后的RT-PCR。细 胞表达NPHS1、AQP2、PAX2、0CLN，用ACTB作为看家基因。
[0038] 图19描述了显示当向患有甘油诱导之ATN的nu/nu小鼠注射hAFSC时在3天期 间内hAFSC对血肌酸酐之影响的图。对照组（仅有损伤以及损伤加上载体对照PBS)显示 在48h至72h之间肌酸酐水平的增加，而经hAFSC处理的小鼠则没有显示峰图，其维持与生 理参数0. 6mg/dl相近的肌酸酐水平。
[0039] 图20提供了一组柱状图，其详细描述了与向肾中注射hAFSC同时与肌内注射甘油 以诱导ATN的小鼠相比，在对照小鼠（绿色）、患有甘油诱导之横纹肌溶解ATN的小鼠（蓝 色）肾脏中表达的小鼠和人类细胞因子谱（鼠源细胞因子以红色阴影条显示，人源细胞因 子以红色条显示）。数值为平均值土SD。细胞因子基于其在炎症期间主要的生物学活性分 成4个广义功能组：1.抗炎性；2.促炎性；3.化学吸引剂；以及4.多种生物学作用。在24h 和48h评估了小鼠全肾中表达的细胞因子谱。
[0040] 图21描述了通过实时PCR测定的在亚群AKPC中表达之基因的总结。
[0041] 图22描述了在羊水（AF)中鉴定出的不同细胞谱系。
【具体实施方式】
[0042] 申请人已通过跟踪羊水总细胞群随时间的存在并研宄羊水细胞组成在妊娠期间 发生的变化对羊水总细胞群进行了表征，集中研宄了来源于3个胚层的细胞和器官的祖细 胞。已经从羊水中分离出了显示肾脏祖细胞（包括肾小管和肾小球前体）特性的细胞亚群。 这些细胞已经用于例如医学治疗和研宄中。
[0043] 定义
[0044] 本文中使用的下列术语定义为下述含义：
[0045]"祖细胞"是在干细胞分化过程中产生的细胞，具有其终末分化的后代的一些但非 所有特性。所定义的祖细胞，例如"肾脏祖细胞"，是指某谱系（肾脏的），而不是特定的或 终末分化的细胞类型。
[0046] 术语"经分离"或"经富集的群"是指不与一种或多种细胞或者一种或多种细胞组 分相关联的细胞，所述一种或多种细胞组分与体内在细胞相关联。
[0047] "对象"是脊椎动物，例如哺乳动物，包括人。哺乳动物包括但不限于人、农场动物、 运动动物（sport animal)和伴侣动物。术语"动物"包括狗、猫、鱼、沙鼠、豚鼠、仓鼠、马、 兔、猪、小鼠、猴（例如猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩）、大鼠、绵羊、山羊、牛和鸟。能够受益于本 发明细胞和方法的对象包括但不限于由于物理性损伤或疾病相关损伤而导致肾细胞功能 丧失的那些对象。
[0048] "有效量" 一般是指提供所期望的局部或全身效果和/或性能的量，特别是用于治 疗目标病症时。例如，有效量是足以产生有益或所期望之临床效果的量。所述剂量可以一 次或多次施用，并且可以包括任意预选的细胞量。可以基于每个对象各自的因素来精确确 定被认为是有效剂量的量，所述因素包括其身材大小、年龄、损伤大小以及从损伤发生或患 病开始计的时间长短。本领域技术人员，特别是医生，应当能够确定构成有效剂量的细胞数 量。
[0049] "扩增"是指细胞增殖而不分化。
[0050] 本文中使用的"进行性肾病"是指随时间推移（例如天、周、月、年）而导致肾功能 丧失的任意肾病。
[0051] "肾功能" 一般是指肾脏的生理学性质，例如滞留蛋白从而防止蛋白尿症（例如尿 肌酸酐，蛋白质的排泄量大于约0. 15克/24小时）的能力。可以例如通过肾小球滤过率 (例如肌酸酐清除）、尿蛋白排泄、血尿氮素、血清或血浆肌酸酐或者其任意组合来对肾功 能进彳T评估。
[0052]"足细胞"是肾脏脏层上皮中特化的、高度分化的周细胞样细胞。足细胞形成 肾小球过滤屏障的重要组分，对其大小和电荷选择起作用，并且维持大量的过滤表面。 "Pedicel"（或者"足突"）从足细胞中延伸出来。这些精巧的足突覆盖在肾小球毛细血管 的外基底膜表面上。相邻的足细胞相互交叉，覆盖在与肾小球毛细血管紧密联系的基底膜 上；但是，仍然存在间隙或细微的滤过隙。当足细胞收缩时，导致滤过隙关闭。这通过减少过 滤可用的表面区域使得肾小球滤过率（GFR)降低。此外，已知足细胞使得基质分子合成肾 小球基底膜（GBM)，包括IV型胶原、层粘连蛋白、巢蛋白（entactin)和聚集蛋白（agrin)。 足细胞损伤或缺失导致蛋白尿症，其中大量蛋白从血液中流失。此外，足细胞缺失是糖尿病 性和非糖尿病性进行性慢性肾病（CKD)的标志。
[0053] "自我更新"是指产生复本子代细胞的能力，所述复本子代细胞具有与其来源细胞 相同的分化潜能。本文中使用的类似术语是"增殖"。
[0054] 本文中使用的"治疗"包括治疗、逆转、预防、改善或抑制损伤或疾病相关状况，或 者损伤或疾病相关状况的症状。
[0055] "共施用"可包括同时和/或依次施用两种或更多种药剂/细胞类型。
[0056] 术语"包含"、"包括"等具有美国专利法中所描述的含义，其可以指"包含"、"含有" 等。本文中使用的"包含"或"包括"等指不受限制的包含或包括。
[0057] 来源于羊水之肾脏祖细朐的分离、牛长和表征
[0058]本发明涉及经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞 群和其分离、培养、分化方法以及其用途。其分离、生长和表征在下面实施例中进行详细描 述。
[0059]此外，在分离时和分离后，可将本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞群培养于本领 域熟知且可由美国典型培养物中心（American Type Culture Colletion，ATCC)商购获得 的培养基中。这样的培养基包括但不限于Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)、 DMEM F12培养基、Eagle's Minimum Essential Medium、F_12K培养基、Iscove's Modified Dulbecco's Medium或RPMI-1640培养基。本领域技术人员可根据所使用细胞的需要来修 改或调整培养基和/或培养基添加物的浓度。还很明显的是，可以使用低葡萄糖配方、有或 没有丙酮酸钠的多种培养基。
[0060]还可以考虑添加含有哺乳动物血清的细胞培养基。血清常含有生存和增殖所需的 细胞因子和组分。血清的实例包括胎牛血清（FBS)、牛血清（BS)、小牛血清（CS)、胎小牛血 清（FCS)、新生小牛血清（NCS)、山羊血清（GS)、马血清（HS)、人血清、鸡血清、猪血清、绵羊 血清、兔血清、大鼠血清（RS)、血清替代品和牛胚胎液。应当理解，如果认为需要使补体级联 反应的组分失活，则可将血清在55-65°C热灭活。还可以调整血清浓度或者从培养基中去除 血清，以促进一种或多种所期望细胞类型的存活。在一个实施方案中，将所述来源于羊水的 肾脏祖细胞在存在对该物种细胞类型特异性的FBS/或血清的情况下培养。例如，可以用约 0? 5%至约5%或者更高（包括约5%至约15% )的总血清（例如FBS)浓度使来源于羊水 的肾脏祖细胞分离和/或扩增。可以凭经验确定血清浓度。
[0061]还可以使用额外的添加物，从而为细胞提供用于最佳生长和增殖的微量元素。 这样的添加物包括胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠及其组合。这些组分可以包含在盐溶液 中，所述盐溶液例如但不限于 Hanks'Balanced SaltSolution?(HBSS)、Earle's Salt Solution?、抗氧化添加剂、MCDB-201?添加剂、磷酸盐缓冲盐水（PBS)、N-2-羟乙基哌嗪-N' -乙磺酸（HEPES)、烟酰胺、抗坏血酸和/或抗坏血酸-2-磷酸酯以及 额外的氨基酸。很多细胞培养基已经含有氨