基酸；但是一些培养基需要在培养细胞前添加。 这样的氨基酸包括但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天门冬氨酸、L-天门冬酰胺、L-半 胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-肌醇、L-异亮氨酸、 L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸。
[0062] 细胞培养中通常还使用抗生素来减轻细菌、支原体和真菌污染。通常所使用 的抗生素或抗霉菌化合物是青霉素/链霉素混合物，但是还可以包括但不限于两性霉 素（Fungizone?)、氨苄青霉素、庆大霉素、博来霉素、潮霉素、卡那霉素、丝裂霉素、 麦考酚酸、萘啶酸、新霉素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、嘌呤菌素、利福平、奇霉素 (spectinomycin)、四环素、泰乐菌素和博来霉素（zeocin)。
[0063] 细胞培养中还可以有利地使用激素，其包括但不限于D-醛甾酮、乙烯雌酚（DES)、 地塞米松、0 -雌二醇、氢化可的松、胰岛素、催乳素、孕酮、生长激素抑制素/人生长激素 (HGH)、促甲状腺素、甲状腺素和L-甲腺原氨酸。0 -巯基乙醇也可以添加至细胞培养基中。
[0064] 脂质和脂质载体也可以用于添加至细胞培养基中，这取决于细胞类型和经分化细 胞的命运。这样的脂质和载体可以包括但不限于环糊精（a、0、Y)、胆固醇、与白蛋白缀 合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-花 生四烯酸、与白蛋白未缀合和缀合的油酸等。类似地，白蛋白可以用于无脂肪酸配方中。
[0065] 培养中的细胞可以保持在悬浮液中或者贴壁于固体载体（例如胞外基质组分和 合成物或者生物聚合物）。细胞通常需要促进其依附于固体载体的附加因子（例如粘附因 子），例如I型、II型和IV型胶原、伴刀豆球蛋白A、硫酸软骨素、纤连蛋白、"超级纤连蛋白" 和/或纤连蛋白样聚合物、明胶、层粘连蛋白、多聚D和多聚L赖氨酸、Matrigel?、凝血酶敏 感蛋白（thrombospondin)和/或玻璃粘连蛋白。
[0066] 细胞的维持条件还可以含有允许细胞（例如本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞） 保持未分化形式的细胞因子。在细胞必须保持自我更新的未分化状态的情况下，培养基中 含有表皮生长因子（EGF)、血小板衍生生长因子（PDGF)、白血病抑制因子（LIF)、碱性成纤 维细胞生长因子（bFGF)及其组合是有利的。本领域技术人员应当清楚，分化前应当从培养 基中去除使细胞自我更新（例如，以产生与所来源细胞具有相同分化潜能的复制子细胞； 本文中使用的类似术语是"增殖"）而不分化的添加物。还很明显的是，并非所有细胞均需 要这些因子。事实上，这些因子可以根据细胞类型引发不期望的作用。
[0067] 可以基于本文中描述的标志物（基因和/或蛋白质）对本发明的来源于羊水的肾 脏祖细胞进行选择。因此，阳性选择方法可以单独使用，也可以与上面描述的用于鉴定和/ 或分离本发明细胞的方法一起使用。阳性选择方法可以包括利用显微镜和/或其他检测方 法的视觉筛选，其包括但不限于免疫印迹、免疫荧光和/或酶联免疫吸附测定。其他阳性选 择方法还可以包括但不限于附加选择性培养技术（例如可变的细胞密度或〇) 2量）、流式细 胞术、RT-PCR和/或基于微芯片的细胞分离方法。还可以使用阴性筛选方法。
[0068] 诱导来源于羊水的肾脏祖细朐分化
[0069] 利用合适的生长因子、化学因子和/或细胞因子，可以诱导本发明的来源于羊水 的肾脏祖细胞分化形成多种细胞。经过CD24+0B-钙粘蛋白+的初步选择，从来源于后肾间 充质组织的不同细胞谱系中分离得到了 5个不同的祖细胞亚群。
[0070] 用分别表达足糖萼蛋白和肾病蛋白的两个细胞群鉴定了足细胞祖细胞。为了使细 胞分化更加完全，使用不同组合的ATRA(1-10 yM)、维生素D3(100nM)和/或地塞米松（最 初24-28小时为100nM)培养接种于IV型胶原覆盖之孔中的细胞。
[0071] 通过TOGF受体a的表达来鉴定间充质祖细胞，并且通过将TOGFa和/或TOGF0 加入培养基中来使其分化。
[0072] 用E-钙粘蛋白+亚群选择肾小球上皮细胞的祖细胞，用BMP-7使其成熟，而通过 将VEGF加入培养基中使表达TrKA的基质源性间充质细胞分化。
[0073] 来源于羊水的肾脏祖细朐的用涂
[0074] 本发明中来源于羊水的肾脏祖细胞可以用来产生肾脏谱系，其包括但不限于足细 胞、肾小球细胞类型、远端和近端肾小管上皮细胞以及间充质细胞。
[0075] 因此，一个实施方案提供了用于提供肾脏细胞的方法，所述细胞可包括但不限于 足细胞、肾小球细胞类型、远端和近端肾小管上皮细胞以及间充质细胞，该方法包括在分化 因子存在下使本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞分化并分离细胞。所述分化因子可以是但 不限于ATRA、维生素3、地塞米松、BMP-7和/或多种不同类型的IV型胶原或其组合。分化 可以发生于体外、体内或离体中。
[0076] 本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞和其他难以培养的细胞可以受益于与其他细 胞类型的共培养。这样的共培养方法来自下述发现：某些细胞可以提供允许细胞分化成特 定谱系或细胞类型的未经鉴定的细胞因子。这些细胞因子还可以诱导细胞表面受体的表 达，其中的一些细胞表面受体可容易地被单克隆抗体所识别。通常可以基于本领域技术人 员希望诱导的谱系类型来选择共培养的细胞，并且本领域技术人员有能力选择合适的共培 养细胞。
[0077] 可以利用本领域熟知的方法来鉴定并随后分离已分化的细胞（从其未分化形式 分离）。可以通过在已分化细胞数量多于未分化细胞数量的条件下选择性地培养细胞，来鉴 定已被诱导分化的细胞。这些条件包括例如延长细胞在培养基中生长的时间，从而促进所 期望的细胞类型存活。很多原代细胞在一段时间后会衰老而不能分裂，或者死亡。其他条 件包括调整血清类型和浓度，或者在诱导分化成其它细胞类型的生长因子和/或细胞因子 的存在或不存在下培养细胞。还可以通过调整血清浓度或者从培养基中去除血清来有利地 实现分化。其他诱导分化的方法可包括但不限于在培养过程中调节培养基的酸度以及氧和 二氧化碳水平。
[0078] 类似地，可以通过形态学变化和未分化形式中不存在的特征（例如细胞大小、细 胞突起的数量和胞内细胞器分布的复杂性）来鉴定已分化的细胞。还可以考虑通过特异性 细胞表面标志物（例如细胞受体和跨膜蛋白）的表达来鉴定经分化之细胞的方法。可以使 用抗这些细胞表面标志物的单克隆抗体来鉴定已分化的细胞。可以通过荧光激活细胞分选 术（FACS)和/或酶联免疫吸附测定（ELISA)来检测这些细胞。从特定基因转录水平上调 的观点来看，已分化的细胞常常显示与未分化细胞不同的基因表达水平。还可以使用逆转 录聚合酶链式反应（RT-PCR)来监测响应于分化的基因表达变化。此外，可以使用利用微阵 列技术的全基因组分析来鉴定已分化的细胞。
[0079] 因此，一旦鉴定了已分化的细胞，如有需要，则可将其与其未分化形式分离开。上 面详细描述的鉴定方法还提供了分离方法，例如FACS，优选细胞培养方法、ELISA、磁珠及其 组合。本发明的一个实施方案涉及利用FACS基于细胞表面抗原表达来鉴定和分离细胞。应 当理解，鉴定和分离方法不限于分析已分化的细胞类型，还可以用来鉴定未分化的细胞类 型，例如本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞。
[0080] 本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞还可以用于细胞置换治疗中。可以将本发明的 来源于羊水的肾脏祖细胞施用至对象的目标组织中，以补充功能性细胞或置换已丧失功能 的细胞。或者，还涉及提供已分化细胞的方法，其中将本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞在 分化因子存在下分化、分离并施用入或施用至对象的身体上。在一个实施方案中，所述已分 化细胞是肾脏谱系细胞。
[0081] 以肾脏质量和/或功能之丧失为特征并且可受益于本发明的来源于羊水的肾脏 祖细胞和方法的疾病状态可以包括但不限于肾脏疾病或损伤。例如，本发明细胞的一个治 疗用途是用于治疗患有肾脏疾病的对象、促进对象中新组织的生长或促使对象中受损组织 的存活。本发明细胞的治疗用途包括治疗肾脏疾病。所述肾脏疾病可以是例如肾脏肾皮层 或者肾髓质中肾小球、肾小管或间质组织之任何变化、损伤或创伤的结果或者影响。所述肾 脏疾病可以是急性或慢性的。
[0082] 如果对象已经被诊断为患有或者被认为患有通常导致与功能性肾单位的进行性 丧失相关之肾脏功能进行性丧失的状况，则可以认为所述对象患有慢性肾衰竭或处于慢性 肾衰竭的风险中，或者处于需要肾置换治疗的风险中。这样的状况或原因包括但不限于慢 性肾衰竭、终末期肾病、高血压性肾硬化症、遗传性肾炎、肾脏发育异常、糖尿病、败血症、脱 水、药物（例如由于摄入利尿剂、NSAID(包括布洛芬和萘普生）、抗生素例如氨基糖苷类 (庆大霉素、妥布霉素）、锂和含有碘的药物导致的水分过度流失）、由于肾动脉或静脉阻塞 而导致的血液供应减少、横纹肌溶解、多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮、膀胱梗阻、高血压、 前列腺肥大或前列腺癌、肾癌、肿瘤、肾结石等。
[0083] 在一些实施方案中，所述肾脏疾病是进行性肾脏疾病。在一些实施方案中，所述 肾脏疾病是进行性肾小球肾病。特别适于用本文中描述的方法进行治疗的进行性肾小球 肾病包括例如糖尿病性肾病（例如作为I型或II型糖尿病或者系统性红斑狼疮的结果）、 原发性肾小球肾炎（例如膜性肾病、局灶节段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫 增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾 炎（包括IgA肾病）、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、高密度沉积性 肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎（包括管外肾小球肾炎）和硬化性肾小球肾炎）和继 发性肾小球肾炎（例如缺血性肾病、基于系统性疾病的肾小球疾病（包括狼疮性肾炎和 Goodpasture综合征）、基于血管疾病的肾小球疾病（包括肾小管栓塞）、基于代谢性疾病的 肾小球疾病（包括糖尿病性肾病和淀粉样变性）、遗传性肾脏病变（包括奥尔波特综合征， 其源于IV型胶原a 3、a 4或a 5链的突变，所述胶原构成肾、耳和眼的基底膜）和经移植 的肾小管病变）。其他的肾脏疾病包括Finnish型肾病、缺血-再灌注损伤、先天性肾病综 合征、肾盂肾炎、间质性肾炎、急性肾小管坏死、药物或毒物性肾病、急性肾炎综合征、快速 进行性肾小球肾炎综合征、复发性和持续性血尿症、以及慢性肾炎综合征。
[0084] Alport综合征（AS)是一种明确确定的慢性肾病（CKD)模型，所述慢性肾病导致终 末期肾病（ESRD)。AS是一种罕见的遗传性肾小球肾炎，每20, 000人中有1人患有这种疾 病。它由IV型胶原的遗传缺陷引起，所述缺陷导致不能产生正常的肾小球基底膜（GBM)。 肾脏损伤和最终的ESRD与肾小球硬化和肾小管间质性纤维化（与成纤维细胞活化有关）、 炎症和胞外基质重组有关。在男性中，慢性肾炎更快发展为ESRD。在一些家庭中，AS可能 与听力丧失和其他病症（包括眼、皮肤、血小板、白细胞以及平滑肌肿瘤）有关。约80%的 患病家庭显示X染色体伴性遗传，而其余的则是常染色体显性或者隐性遗传。目前，没有明 确的治疗方法来延缓Alport综合征患者向ESRD的发展。可以利用两个小鼠模型（常染色 体隐性遗传的129col4 a 3_/_和X染色体伴性遗传的C57BL col4 a 5_/_)来研宄AS。
[0085] 本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞可以用于多种不同的临床和临床前应用中，其 可包括但不限于用于毒物学或基因组学筛选方法、测定酶的水平以及治疗本文中公开的疾 病。本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞可以为高通量毒物学或基因组学筛选提供多种已分 化的培养细胞类型。这些细胞可以培养于例如96孔或其他多孔培养板中，以在药物基因组 学或药物遗传学中为例如靶标细胞因子、化学吸引剂、生长因子或药物组合物的高通量筛 选提供系统。
[0086] 因此，本发明提供了本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞用于检测细胞对生物活性 (生物学或药物学）试剂之细胞反应（例如毒性）的用途，其包括使细胞的培养物或其分化 的后代与一种或多种生物学或药物学试剂相接触，鉴定细胞对一种或多种生物学或药物学 试剂的一种或多种细胞反应，并将所述细胞培养物的细胞反应与对照培养物的细胞反应进 行比较。
[0087] 本发明还涉及组织工程器官或其部分或其特定区段，以及涉及组织工程设备，所 述设备包含目标组织以及任选的细胞因子、生长因子或诱导分化成所期望细胞类型的分化 因子，其中使用本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞来产生肾脏组织。组织工程器官可以与 可生物降解的生物相容性支架一起使用，以支持细胞以三维构造生长。由本发明的来源于 羊水的肾脏祖细胞产生的组织工程器官可以移植入需要置换器官或其部分或其特定区段 的对象中。本发明还涉及本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞或由其分化的细胞用作生物反 应器之一部分的用途。
[0088] 由本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞产生的同源器官、其部分或区段可以移植入 宿主中。同样地，由本发明的来源于羊水的肾脏祖细胞被诱导分化为多个组织类型而产生 的异源器官、其部分或区段可以移植入有需要的对象中。移植可以是自体同源性的，即器官 或器官单位所来源细胞的供体是工程组织的接受体。移植可以是异源的，即器官或器官单 位所来源细胞的供体不是工程组织的接受体（例如同种异源的或异种的）。
[0089] -旦转移入宿主，组织工程器官就可再现宿主自身组织的功能和构造。组织工程 器官将在广泛应用中使对象受益，包括治疗癌症和本文中公开的其他疾病、先天性缺陷或 由于手术切除引起的损伤。
[0090] 来源于羊水之肾脏祖细朐的施用
[0091] 为了本文中描述的目的，可以向对象施用自体同源、同种异源或异种的本发明的 来源于羊水之肾脏祖细胞，其可以是已分化或未分化形式，可经遗传改变或未改变，可通过 直接注射至组织部位、全身注射、注射至可接受之基质的表面或周围、以封装形式或者与可 药用载体组合施用。
[0092] 可以通过本领域已知的多种方法向对象施用本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞。 可以通过局部或全身注射向对象施用本发明的来源于羊水之肾脏祖细胞。
[0093] 在一个实施方案中，将细胞悬浮液抽吸入注射器中并向对象施用。利用该方法可 进行多次注射。使用这样的细胞悬浮液方法提供很多优势。例如，这些方法将细胞引入任 意预定部位，并且相对无创。
[0094] 通常，移植入对象的细胞数量是"治疗有效量的"。本文中使用的"治疗有效量"是 指为有效治疗特定损伤或所寻求治疗之疾病所需的移植细胞的数目。例如，治疗组织损伤 时，移植治疗有效量的细胞通常使得与损伤相关之症状的数量和/或严重程度减少。本领 域技术人员应当理解如何确定合适的细胞剂量。
[0095] 根据需要，可以通过对宿主施用诱导细胞增殖和分化的任意生长因子、细胞因子 或药物组合物，来诱导本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞及其分化之后代的体内增殖和/ 分化。这些生长因子、细胞因子或药物组合物包括本领域已知的任意生长因子、细胞因子或 药物组合物，包括本文中描述的用于体外增殖和分化的生长因子和细胞因子。
[0096] 外源性因子（例如细胞因子、分化因子和其他因子）可以在施用本发明的来源于 羊水的肾脏祖细胞之前、之后或同时施用。例如，同时施用的形式可以包括施用前将培养基 中的目标因子和/或可药用载体混合。施用的剂量是可变的，可以包括初次施用以及接下 来的随后施用；但是不管怎样，其可以由本领域技术人员由本文公开内容、本文中所引用的 文件以及本领域知识来确定。
[0097] 本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞的治疗用途中涉及的一个参数是达到最佳效 果所需的细胞数量。不同的情况可能需要对注射进目标组织的细胞量进行优化。例如，施 用的细胞量可以随所治疗的对象而变化。在一个实施方案中，可以对人对象施用1〇 4至108、 更优选1〇5至10 7和最优选3 X 10 7个细胞，以及任选的每天50至500 y g/kg的细胞因子。 但是，可以基于每个患者的各个因素来精确地确定被认为是有效的剂量，包括其身材大小、 年龄、组织损伤大小以及从损伤发生开始的时间长短。因此，剂量可以由本领域技术人员由 本文公开内容和本领域知识而容易地确定。
[0098] 本发明中来源于羊水之肾脏祖细胞的治疗用途中涉及的另一个参数是细胞群的 纯度。例如，羊水包含混合的细胞群，其可以被纯化至足以产生所期望效果的程度。利用多 种众所周知的方法（例如荧光激活细胞分选（FACS))，本领域技术人员可以容易地确定本 发明的来源于羊水的肾脏祖细胞在细胞群中的百分数。在包含本发明的来源于羊水之肾脏 祖细胞的细胞群中，纯度的优选范围是约1至约5%、约5至约10%、约10至约15%、约15 至约20%、约20至约25%、约25至约30%、约30至约35%、约35至约40%、约40至约 45%、约45至约50%、约50至约55%、约55至约60%、约60至约65%、约65至约70%、 约70至约75%、约75至约80%、约80至约85%、约85至约90%、约90至约95%、约95 至约100%。可以根据细胞群内细胞表面标志物谱来确定细胞的纯度。本领域技术人员可 以容易地对剂量进行调整（例如，纯度减少则需要增加剂量）。
[0099] 当施用本发明的治疗组合物时，通常将其制成单位剂量的可注射形式（溶液、混 悬液、乳液）。适于注射的药物制剂包括无菌的液体溶液和分散体系。载体可以是含有例如 水、盐水、磷酸缓冲盐水、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇液体等）及其适宜混合物的 溶剂或分散介质。
[0100] 此外，可以添加增强组合物之稳定性、无菌性和等渗性的多种添加剂，包括抗微生 物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。多种抗细菌和抗真菌剂（例如对羟基苯甲酸酯、氯 丁醇、苯酚、山梨酸等）可以确保防止微生物作用。在很多情况下，包含等渗剂（例如蔗糖、 氯化钠等）是理想的。使用延缓吸收剂（例如硬脂酸铝和明胶）可以带来可注射药物形式 的持久吸收。但是根据本发明，所使用的任何载体、稀释剂或添加剂均须与细胞相容。
[0101] 根据需要，可以通过将所需量的实施本发明所用的细胞加入到含有多种量的其它 成分的合适溶剂中，来制备无菌注射溶液。包含本发明之祖细胞的组合物的实例包括用于 施用的液体制剂，包括混悬液；以及用于肌内或静脉内施用（例如注射施用）的制剂，例如 无菌混悬液或乳液。这样的组合物可以与适宜的载体、稀释剂或赋形剂（例如无菌水、生 理盐水、葡萄糖、右旋糖等）混合。组合物还可以是冻干的。根据施用途径和所需制剂，所 述组合物可包含辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝剂或增强粘性的添加 剂、防腐剂、调味剂、色素等。可以参照标准文章（例如"REMINGTON' S PHARMACEUTICAL SCIENCE"，第17版，1985,其通过引用并入本文）来制备合适的制剂，而无需进行过度的实 验。
[0102] 本发明的组合物可以以液体制剂的形式方便地提供，例如等渗水溶液、混悬液、乳 液或粘性组合物，可将其缓冲至所选的pH值。液体制剂一般比凝胶剂、其他粘性组合物和 固体组合物更易于制备。此外，液体组合物在某种程度上更便于施用，特别是通过注射施 用。另一方面，可以在合适的粘性范围内制备粘性组合物，以提供与特定组织的较长接触时 间。
[0103] 适宜载体和其他添加剂的选择取决于施用的确切途径和特定剂型的性质，例如液 体剂型（例如，组合物制备成溶液、悬液、凝胶或者另一种液体形式，例如缓释形式或者充 液形式）。
[0104] 除细胞之外，溶液、混悬液和凝胶一般含有大量的水（例如纯化灭菌水）。还可以 存在少量的其他成分，例如pH值调节剂（例如碱，如NaOH)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐 剂、润湿剂和胶凝剂（例如甲基纤维素）。组合物可以是等渗的，即其可具有与血液和泪液 相同的渗透压。
[0105] 可以利用氯化纳或其他可药用试剂（例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或者其 他无机或有机溶质）来实现本发明组合物之所期望等渗性。
[0106] 如果需要，可以利用可药用增稠剂来使组合物的粘性保持在所选水平上。甲基纤 维素易于得到、较为经济且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、 羟丙基纤维素、卡波姆（