。其自我更新和多能 性特性已经表明，干细胞可以用于修复受损组织和重建受损器官，例如作为受损组织修复 和器官离体重建的有用工具。广泛研宄了胚胎干细胞（ES细胞）产生胚胎全部细胞类型和 胚外组织的能力，但是伦理学争议妨碍了其在治疗中的应用。已经提出将间充质干细胞作 为有用的治疗工具，其不存在针对ES细胞提出的伦理和临床方面的问题，因而成为可靠的 替代品。MSC是多能性非造血细胞，能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和心肌细胞。
[0181] 骨髓和脐带血是众所周知的间充质细胞以及造血细胞、血流细胞（例如红细胞、 淋巴细胞、巨噬细胞）祖细胞的来源。造血细胞用于治疗白血病和血液病症，正在对间充质 干细胞进行大量的研宄，以研宄其再生潜力。
[0182] 脐带血表现出一些优点，例如易于得到新样品，细胞处于未成熟状态以及不存在 细胞修复的风险。骨髓可以成为理想的适合物，因为患者自身可以是供体。自体同源细胞 在体外扩增后可以重新移植进入骨髓，以避免任何免疫反应。
[0183] 已经研宄将成体干细胞用作不同器官再生的可能工具，但是组织中存在的细胞数 量较少，难于对这些细胞驻留的位置（niches)进行定位，并且其分化潜能有限，这些已明 确地限制了其吸引力。
[0184] 羊水（amniotic fluid，AF)，由于其来源以及与发育中的胎儿接触，因而包含大量 多种悬浮细胞，所述细胞已经广泛用于诊断目的。最近，已经从AF中分离出同时表现出胚 胎干细胞和间充质干细胞特性的干细胞。其易于获得，避免了伦理学纠纷，并且能够在培养 基中繁殖而同时保持其多能性（Prusa和Hengstschlager，2002)。除了干细胞之外，还假定 羊水中存在其他细胞类型，例如定型祖细胞和成体细胞。
[0185] 羊水中的干细胞构成总细胞群的不超过1%，关于其他细胞类型的特性几乎是未 知的。虽然来源于3个胚层的细胞因产生不同细胞谱系（其具有多种且有时是完全不同的 功能）的能力而吸引了科学家的兴趣，但是还没有对羊水中存在之定型谱系祖细胞进行重 要研宄。因此，本实施例的主要重点是AF中已经丧失多能性并因此定向分化为确切谱系 (该谱系可产生有限数目的不同细胞）的那些细胞。
[0186] 对15-20周之间孕龄范围的人男性羊水样品进行处理。由于羊水组分随孕期胎儿 发育而变化，因此通过根据孕龄将样品分组而确定可以获得关于细胞组成的更多信息。
[0187] 胚胎的发育包括3个胚层中细胞的分化，所述3个胚层是内胚层、外胚层和中胚 层。细胞分化的这3个途径涉及通过由多能性状态（pluripotent state)变为复能性状态 (multipotent state)而导致潜能丧失。内胚层产生肺、肝、膀胱、消化道；外胚层产生脑、 脊索、皮肤、毛发和眼；而中胚层产生脂肪组织、骨、骨骼肌和内皮。
[0188] 如本文中所显示，发明人成功地鉴定了表达所有3个胚层的细胞、间充质细胞和 造血细胞、不同器官的祖细胞，以及特别是显示肾脏特性的细胞，包括足细胞前体、肾小管 上皮细胞和系膜细胞。
[0189] 在孕期中，人胚胎发育遵循精确的时间表。AF中的细胞在不同孕期时间点定向分 化成为多种器官。在所研宄的时间范围中，较早样品更频繁并且以较高水平表达与中胚层 和内胚层有关的标志物，而在较晚样品中，由于AF细胞随时间分化并且从胎儿分离之细胞 的成熟程度不同，这些标志物表达的频率和数量减少。此外，可能由于器官发生过程的成 熟，器官特异性标志物的表达随孕期而增加。
[0190] 大部分AF体积来源于胎儿尿液，因此，假定肾脏祖细胞构成AF的主要成分是合理 的。肾脏标志物（例如？4乂-2、1頂-1、肾病蛋白、1^6?狀、了^^4-钙粘蛋白、〇)24和08-钙 粘蛋白）的表达量显示在第17周孕龄末期明显增加。
[0191] 已经表明肾脏祖细胞存在于AF的总细胞群中，基于报道⑶24和OB-钙粘蛋白共 表达于发育中的肾脏中并且特别地共表达于后肾间充质组织（MM，其与输尿管芽一起产生 成熟肾脏）中的体内研宄，从AF中筛选特异性细胞群。该细胞群称为后肾间充质细胞样细 胞（CD24+OB-钙粘蛋白+)，如图22所显示。当UB诱导MM时，⑶NFl、UM-l、PAX-2、BMP-2和 其他基因开始明显表达，这些基因还表达于⑶24+OB-钙粘蛋白+细胞群中。随后，随着肾脏 成熟的进程，基因表达发生改变，并且开始局限于特定的细胞谱系。每种细胞谱系获得通过 特异性基因表达引起并通过表面标志物显示的特性，所述标志物例如E-钙粘蛋白（MET，间 充质-上皮转化细胞）、肾病蛋白（足细胞）、足糖萼蛋白（成熟足细胞）、TRKA(基质源性皮 层间充质细胞）和TOGFRA(系膜细胞）。因此，用这些表面标志物对最初分离的CD24+OB-钙 粘蛋白+细胞群进行额外的免疫筛选。
[0192] 五种⑶24+OB-钙粘蛋白+亚群中基因和蛋白（例如⑶NF、WT-1、UM-1和PAX-2) 的存在决定着肾脏细胞类型的命运。还研宄了 0CT-4的表达，以确定经亚选择的细胞是否 仍然具有多向分化的潜能。在肾脏发育过程中，器官特异性前体经历不同的分化阶段，以达 到成熟状态。在该成熟过程中，多能基因不会突然关闭，而且所有的成熟期特异性基因也不 会突然开启。在中间状态时会发生两种类型之基因的共表达。如图21中的总结所显示， RT-PCR分析证实，来源于⑶24+OB-钙粘蛋白+细胞群的5个亚群均具有肾脏标志物表达的 特定暂时性模式。
[0193] 最令人感兴趣的结果之一是由WT-1的表达（体内表达于后肾S形体邻近部分中 的后肾细胞中并随后专门表达于成熟足细胞中）所揭示的。在所有分离出的亚群中，仅肾 病蛋白+和足糖萼蛋白+的细胞表达WT-1，表明这些确实是足细胞的前体细胞。特别需要强 调的是，例如PAX-2或者LIM-1基因在经筛选的足糖萼蛋白+细胞中没有表达，但是在肾病 蛋白+细胞中明显表达，表明与表达足糖萼蛋白的细胞相比，肾病蛋白+细胞可能代表较为 不成熟的足细胞谱系。足糖萼蛋白+细胞不表达0CT-4而肾病蛋白+细胞高水平表达0CT-4 的发现也支持了这一观点。此外，培养的足糖萼蛋白+细胞显示所培养的人足细胞的典型 形态，呈现出与Vogelmann等所描述相似的主要突起。在其他细胞群中，WT-1没有表达，表 明这些细胞不会定向分化为足细胞。特别地，TOGFRA+细胞的表达模式，即表达PAX-2而不 表达LIM-1，表明其定向分化为肾源性谱系而不是目前认为的MET。此外，0CT-4高度表达， 这是与TRKA+细胞群共有的特性。TRKA +细胞群对于PAX-2、LM-1和TRKA是显著阳性的。 特别地，仅在发育中之肾脏的基质源性皮层间充质细胞中表达的TRKA表明TRKA+细胞的定 向。E-钙粘蛋白+细胞不表达PAX-2,相反，其显示UM-1和E-钙粘蛋白的表达，这表明其 未完成肾原性模式的定向分化。
[0194] 总的来说，除了存在具有多能性特性的少数细胞（1% )之外，AF细胞中其他99% 的组分是多样性的，其中含有大量的细胞亚群，这些细胞亚群表现为定向分化成为特定种 系或组织终点，从非特异性祖细胞到器官特异性祖细胞以及经分化的成熟细胞类型。本文 中对AF中的MM样细胞群进行了鉴定，从中成功地分离出特异性细胞亚群并使其在培养基 中经过几次传代生长。人AF中特异性肾脏祖细胞（特别是足细胞前体）的存在和成功鉴 定表明其是用于再生性治疗（可应用于多种肾脏疾病）的有价值的细胞来源。
[0195]实施例2
[0196] 羊水干细朐用于肾脏再牛-人羊水干细朐在急件肾小管坏死中的保护件作用
[0197] 材料和方法
[0198] 来源于羊水之c-kit阳性干细胞的分离和标记
[0199] 经洛杉矶儿童医院临床研宄委员会（Childrens Hospital Los Angeles Committee On Clinical Investigation)(IRB)批准，由废弃的羊膜穿刺术 (amniocentesis)获得了人羊水样品。由于所获得的样品信息仅限于核型和胎儿健康状 况，因此不需要书面或者口头同意。利用如De Coppi等（2007)所述的以细胞表面标志物 c-kit为对象的标准磁珠分选（MACS)技术（Miltenyi Biotech)，从人羊水细胞总体环境中 分离干细胞群。根据Atala等概述的方案测试克隆群和亚克隆群的多能性。然后将克隆培 养于培养皿中，培养基含有添加了 20% Chang B、2% Chang C溶液、20%胎牛血清、1%谷氨 酰胺和1%青霉素-链霉素抗生素（Gibco/BRL)的a-MEM。利用标准方法确定了用于体内 注射之hAFSC的核型。
[0200] 注射前，在0. 05M胰蛋白酶/EDTA溶液中对hAFSC克隆群进行胰蛋白酶消化，并以 1500rpm离心5min，然后按照厂商的说明进行细胞表面标志物CM-Dil (Molecular Probes) 的标记，以便在注射期间和注射后跟踪细胞。简而言之，将细胞与lmg/ml的CM-Dil于37°C 孵育5分钟，随后于4°C孵育15分钟并用PBS清洗3次。
[0201] 急性肾小管坏死的诱导和注射
[0202] 禁水22小时后，通过肌内注射50 %的高渗性甘油溶液（10ml/kg体重） (Sigma-Aldrich)，在雌性 nu/nu 小鼠（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME Harlan)中 诱导横纹肌溶解诱导的ATN(Acute Tubular Necrosis，急性肾小管坏死）。递送细胞之前， 在麻醉状态下通过外科手术方法暴露大腿根部肌肉并缓慢注射甘油溶液，进行受控的肌内 甘油注射。经洛杉矶儿童医院动物关爱与利用委员会批准，遵守实验室动物关爱与利用国 家研宄机构健康指南（National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)，进行动物实验。
[0203] 利用异氟醚吸入将小鼠小心地麻醉。一旦达到令人满意的麻醉效果，利用氯己定 (clorxidine)准备小鼠外科手术。在背部切开约lcm的小切口，通过切口小心地取出两个 肾脏，利用微注射器 Eppendorf TransferMan NK2 Injector (Eppendorf)，使用 30-33 号针 小心地将hAFSC (在PBS缓冲液中稀释1 X 106倍）注射到两个肾脏的皮层中。接着将肾脏 放回到腹膜后腔，用聚丙烯缝线（Taper C-l，5-0号，90cm)缝合切口，并使小鼠从麻醉中恢 复。在整个麻醉期间，使小鼠保持在加热垫上。缝合伤口前，皮下施用〇.lmg/kg的丁丙诺 啡，并沿切口边缘施用lmg/kg的丁哌卡因（局部麻醉剂），以缓解术后疼痛。将动物遮盖， 以防止肾脏与动物皮肤接触，以减少腹膜炎的风险。对照动物用PBS进行注射。
[0204] 组织处理
[0205] 在不同的时间点（从24小时至3周）处死经注射的小鼠和对照小鼠。将肾脏切 碎，并根据所要进行的分析用以下方法之一进行处理。
[0206] RNA/DNA 提取
[0207] 将肾脏切成小片，并利用Qiagen Rneasy试剂盒根据厂商的说明提取RNA。简而言 之，提取总mRNA并进行逆转录。利用不编码小鼠序列的人特异性引物对所得到的cDNA进 行扩增。在初始变性步骤（95°C，10分钟）后，利用PCR热循环仪（Eppendorf)。变性步骤 在95°C进行30s ;随后是退火步骤，在每个引物特异性温度（范围从54°C至60°C )下进行 45秒；以及延伸步骤，在72°C进行45s，总共进行35个循环。为了排除扩增基因组DNA的可 能性，用无DNA的试剂盒（Ambion Inc.)处理RNA样品。通过利用1%琼脂糖凝胶电泳进行 大小分级，对PCR扩增产物进行检测。对人肌动蛋白的RNA片段（作为看家基因）进 行扩增。引物序列和扩增子的预期大小显示于图14中。
[0208] 为了对基因组DNA进行PCR，以评估萤光素酶基因的存在，依照下列Qiagen DNeasy试剂盒的标准方案进行DNA提取。
[0209] 组织学
[0210] 将肾脏在4%经缓冲的多聚甲醛（Sigma-Aldrich)中于4°C固定8小时，经常规 处理，包埋于石蜡中，做成5 ym切片。简而言之，将肾脏在70%酒精中清洗2小时，随后在 酒精中清洗2次2小时，并置于甲苯中2次40分钟，接着置于甲苯/石蜡溶液中1小时并 于石蜡中过夜。第二天早晨，肾脏完全包埋于石蜡中，准备进行切片。依照标准的组织学 方法，用苏木精和伊红（H&E ;Sigma-Aldrich)、甲苯胺蓝（Sigma-Aldrich)以及过碘酸希夫 (Periodic acid Schiff) (PAS ;Sigma_Aldrich)对切片进行染色。
[0211] 此外，将一些肾脏用液氮冷冻并储存于_20°C。当需要时，将其制成5 ym的冷冻切 片，然后用于免疫组化分析。
[0212] 用萤光素酶-生物发光检测法对AFSC进行标记
[0213] 依照标准方案，用洛杉矶儿童医院Vector Facility制备的慢病毒载体 (SMPU-R-MNCU3-LUC，基于转导了萤火虫萤光素酶基因的HIV-1)对hAFSC进行了转导。通 过去除旧培养基并添加新的病毒上清和培养基进行2轮转导。初次转导后24小时，在移 植或体外分析之前，用磷酸盐缓冲液（PBS)充分清洗细胞3次。体内注射之前，进行简单 的体外测试，以确定通过生物发光可检出的hAFSC最小量。评估了范围从5X 104至2X 10 6 的不同细胞浓度。此外，通过PCR证实了细胞经20次传代培养后仍然表达萤光素酶基因。 将经萤光素酶转导的hAFSC(稀释于PBS中，1 X 106细胞/小鼠）直接注射到从Jackson Laboratories获得之10周龄nu/nu小鼠的肾脏中。利用原型IVIS三维生物发光/荧光光 学成像系统（Xenogen，Alameda，CA)在不同的时间点进行光学成像。
[0214] 在成像之前，对每只小鼠静脉内注射如所描述（Wang等，2003)的剂量为125mg/kg 的萤光素（Promega)。接着用5%异氟醚诱导全身麻醉，并将小鼠置于不透光的加热室中； 在该步骤中，通过鼻锥（nose cone)将2%异氟醚引入，持续进行麻醉。所述成像系统包括 一个冷背照式电荷耦合器件（CCD)照相机，以捕捉用发光二极管获取的动物可见光图像和 发光图像。旋转镜和可移动的动物平台使得可以获得360°的图像。
[0215] 免疫染色
[0216]用荧光染料对冷冻和石蜡载玻片进行染色。将石蜡载玻片脱蜡，置于1%的 Triton中5分钟（如果抗原是细胞核）并在PBS中简单清洗。接着将石赌载玻片置于Vector Antigen Retrieval Solution (Vector Laboratories)中 3 次。冷冻载玻片在 80% 甲醇中 固定5分钟。用抗生物素蛋白/生物素（Vector Laboratories)进行封闭后，利用PBS中 的合适的5%正常血清进行第二次封闭。将载玻片在第一抗体（Vector Laboratories的双 花扁豆凝集素和花生凝集素、Promega的萤光素酶以及Santa Cruz的胶质细胞源性神经营 养因子和水通道蛋白2)溶液中于室温孵育1小时或者于4°C过夜。接着用PBS清洗载玻片 3次，每次5分钟。第二抗体（Vector Laboratories)的浓度在5%正常血清中是1 : 200。 将切片在该溶液中于室温孵育1. 5小时，随后用PBS清洗3次，每次5分钟。接着在PBS缓 冲液中以1 : 500的浓度使用合适的焚光标记物（Vector Laboratories的Texas Red或者 Fluorescein Avidin DCS) 5-10分钟，随后用PBS最后清洗3次，每次5分钟。进行TUNEL 染色（Roche，Applied-Science)，以确定凋亡细胞的存在。简而言之，将细胞与TUNEL试剂 于37°C孵育1小时，接着用PBS清洗。用DAPI封片剂（Vector Laboratories)将载玻片封 片。在实验组中，对每300个细胞核中阳性凋亡细胞核的数量进行计数，将经hAFSC处理的 动物与未处理的对照动物比较。数值为平均值土SD。Leica DM RA荧光显微镜与Open Lab 3. 1. 5软件组合使用，以使染色成像。
[0217] 血液采集，肌酸酐和BUN的测定
[0218] 经洛杉矶儿童医院Animal Core Facility和Saban研宄院批准，用5mm刃口长度 的动物柳叶刀将面静脉切开，并利用标准方案采集血液。将动物分成如下不同的组：1. 10 只动物，用于测定肌酸酐基线水平；2. 10只动物，经历ATN(急性肾小管坏死）但未注射 hAFSC ;3. 10只动物，经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC ;4. 10只动物，经历甘 油诱导的ATN且经甘油注射2小时后肾内注射PBS。
[0219] 将血液样品（30 y 1)采集到含有肝素锂的血浆分离管中。将其以13, 000-RPM离 心3分钟，移去血衆（上层）并在分析前储存于-80°C。在指定的14天期间内对最多15% 的循环血液进行采样（血液总体积约占总体重的0. 6% )。每24小时获得损伤后测定值。 血液样品用于通过分析肌酸酐的水平和BUN的水平监测肾脏功能。根据厂商说明，通过将 30iil血清样品点样于96孔微滴定板中，进行肌酸酐（BioAssay Systems Cat#DUCT-500) 和BUN(BioAssay System Cat#DIUR-500)的ELISA。利用非配对t检验进行组之间的比较。 认为p< 0.05的数值具有统计学显著性。利用GraphPad Prism软件进行分析。数据显示 为平均值土 SD。
[0220] 形态学研宄
[0221] 通过常规方法制备厚度为4 y m的肾脏切片，并如上所述用PAS试剂染色。将肾脏 切片分成6个主要的组：1.经历ATN但未注射hAFSC的小鼠，处死于24小时；2.经历ATN 且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死于24小时；3.经历ATN但未注射hAFSC 的小鼠，处死于48小时；4.经历ATN且经甘油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死 于48小时；5.经历ATN但未注射hAFSC的小鼠，处死于72小时；以及6.经历ATN且经甘 油注射2小时后肾内注射hAFSC的小鼠，处死于72小时。
[0222] 利用PAS染色，基于3个主要参数对肾小管损伤进行了评估：1.肾小管膜的破坏； 2.刷状缘的破坏；和3.管型形成。在实验组中，利用经PAS染色样品中的连续性非重叠区 域，将受损肾小管计数为存在于切片中的肾小管总量的分数。在不知道实验组的情况下对 受损肾小管的百分数进行评估。数值为平均值土SD。
[0223] 细胞因子分析
[0224] 为了检测甘油诱导ATN(注射或未注射细胞）后产生的促炎分子和抗炎分子，利 用多细胞因子阵列技术（Proteome Profiler Array Kit)测定经消化的小鼠肾脏中人和 小鼠细胞因子的水平。简而言之，在细胞裂解缓冲液中将肾脏组织匀浆，将匀浆物于4°C以 12, OOOrpm离心15分钟。利用Cytokine Array Kit (对于人而言批号是ARY005,对于小 鼠而言批号是ARY006)，按照方案说明（R&D Systems，Inc.)测定每个上清液中的总蛋白浓 度。利用 Array Vision Program(R&D Systems，Inc.)分析数据。
[0225] MM
[0226] 注射前hAFSC的表型和核型
[0227] 如图15A所显示，注射前HAFSC表现出成纤维细胞样形状。对注射前hAFSC中早 期和晚期肾脏标志物的表达进行分析。如图15B所显示，hAFSC对于很多肾脏标志物而言 (从早期肾脏发育中表达的转录因子到晚期分化标志物）是阴性的。这使得可以确定当体 外培养时，hAFSC并非特异地定向分化为肾脏祖细胞。
[0228] 对细胞进行测试，以证实体内应用前的正常核型，以便排除可损害其多能性的