染 色体异常（图15C)。
[0229]甘油诱导的肌肉损伤和急性肾小管坏死（ATN)，苏木精和伊红（H&E)，过碘酸希夫 染色（PAS)，TUNEL
[0230] 图16A显示任何损伤前小鼠肾脏（nu/nu)的正常形态。髓质和皮层之间的界线清 晰可见，肾小管和肾小球都是完整的。图16B显示肌内注射甘油3天后的肾脏形态。ATN造 成了显著的结构破坏，以致不能区分髓质和皮层。近端肾小管和远端肾小管的正常结构被 破坏（有管型形成），而大多数肾小球则保持完整。这种类型的损伤是典型的横纹肌溶解诱 导之损伤，其中经历衰竭的肾脏的主要结构是肾小管而非肾小球。在该公认的模型中，主要 的病理学机制是肾脏血管收缩、管腔内管型形成和血红素蛋白直接诱导的细胞毒性（并产 生促进缺血性损伤的自由基）（图16C和16D)。
[0231] 与对照（其未经历甘油诱导的肌肉损伤）相比，凋亡细胞（TUNEL染色）数量增 加。此外，与未经处理的对照小鼠相比，经甘油处理的小鼠中存在的凋亡细胞数量的差异非 常显著。
[0232] 通过生物发光体内检测hAFSC
[0233] 在体内注射前，用编码萤光素酶的慢病毒（在多次群体倍增内稳定表达转基因） 转导hAFSC。图17A显示未经感染的细胞（作为对照）与暴露于萤光素（萤光素酶的底物） 的经感染细胞之间的对比，以确定20次群体倍增后在生物发光检测下信号的存在。在图 17B中，体外实验确定了生物发光检测下光学检出的最小细胞数量是1X10 5个细胞。
[0234] 在容易地检出损伤诱导（图17C)后，将1. 2X 106个hAFSC直接注射到右肾中。左 肾用作对照。信号非常明显，并扩散至身体的多个区域（小图1-2)，例如最初几天扩散至 肺。注射后24小时可以看到肾脏区域中hAFSC的信号（小图3)。48小时和72小时时的 肾脏信号最强，并持续至多达6天（小图4-5)，其后在接下来的几天中信号开始消失（小图 6-7)。但是，在注射后21天，肾脏区域的信号再次明显（小图8)。
[0235] 第21天时对经注射和未注射的肾脏进行DNA提取和PCR，以确定萤光素酶的存在。 结果显示，如看家基因ATCB不存在时所证实的，萤光素酶和人ATCB DNA仅存在于经注射的 肾脏组织中（图17D)。从整个经注射的肾脏中提取DNA。如图17E所显示，对萤光素酶的 阳性免疫染色也证实了该结果。
[0236] 通过免疫组化和基因表达检测受损肾脏中的hAFSC
[0237] 用组织学方法对经注射之hAFSC的存在进行评估。通过表面标志物CM-Dil的红 色荧光所检测的注射后1周的冷冻切片证实了 hAFSC的存在（图18A)。观察到来自hAFSC 的CM-Dil信号与肾脏标志物的荧光染色相重叠，几个实例如下：注射后3周，将萤光素酶阳 性的hAFSC针对水通道蛋白2、花生凝集素、双花扁豆凝集素进行双重染色，表明hAFSC能够 分化成为表达成体远端和近端肾小管凝集素的细胞（图18B-D)。在一些实例中，还在表达 胶质细胞源性神经营养因子（GDNF ;图18E)的肾小球结构中发现了 hAFSC，表明干细胞还能 够表达分化早期的肾小球标志物。
[0238] 21天后，利用人特异性引物对所收集的肾脏进行RT-PCR，并鉴定出经注射之肾脏 中hAFSC所表达的几种特异性人肾脏基因（分化早期和晚期的标志物）：肾病蛋白、水通道 蛋白2、Pax-2和Occl (与注射前的hAFSC相比）（图18F)。
[0239] 肌酸酐和血尿氮素（BUN)的测定
[0240] 用10只nu/nu小鼠的对照组来确定任何处理前血清肌酸酐的基线水平，其平均为 0. 6mg/dl。第0天肌内注射甘油后，肌酸酐的水平增加至高达1. 10mg/dl，注射后48小时和 72小时之间显示出峰值。
[0241] 类似地，注射甘油后UBN的水平（基线水平为27mg/dl)增加，并在约48小时和72 小时检测出峰值。3周后肌酸酐和BUN的浓度回复至正常水平。进一步的分析表明，在肌内 注射甘油后注射盐水介质溶液的动物与注射甘油后未注射盐水介质溶液的动物之间，肌酸 酐和BUN的水平没有统计学上的显著差异，因此，将这些组合并进行统计学分析。相反，经 历肌内注射甘油诱导之损伤并接受肾脏内注射hAFSC的动物显示，在预期的损伤急性期中 肌酸酐和BUN的水平没有增加。
[0242] 形态学研宄
[0243] 从24小时至72小时，观察到在经甘油处理的动物中受损肾小管的数量增加。到 72小时时，由于受损肾小管内的管型形成，损伤更加严重。与未注射干细胞的动物相比，在 经甘油注射且用hAFSC处理的动物中受损肾小管的数量在48小时时增加，但是到72小时 时受损肾小管的数量显著减少。双因素AN0VA显示出时间的非常显著的影响（p = 0.03) 以及时间和处理之间的相互作用（P = 0. 01)。
[0244] 免疫细胞因子谱
[0245] 由于在ATN急性期中注射hAFSC产生有益作用，因此该保护性作用可能涉及肾脏 细胞因子环境的急性变化。肌内注射甘油后24小时和48小时，将人以及小鼠肾脏中表达之 细胞因子的细胞因子谱与未受损对照组和经甘油注射且肾内注射hAFSC的小鼠的进行比 较。细胞因子水平以全面的依次性柱状图组（平均值和SD)显示于图20中。为了相对易于 解释，不同的细胞因子基于其主要的免疫学功能显示为4个广义功能组：1.抗炎性；2.促 炎性；3.化学吸引剂；和4.多种生物学作用。对于单个细胞因子而言，图中的柱从左至右 显示：对照的细胞因子水平；24小时时的ATN肾脏；以及24小时时经hAFSC注射的ATN肾 脏（显示为来源于小鼠和来源于hAFSC之人细胞因子水平的总和）。然后在48小时时重复 该显示顺序。
[0246] 小鼠特异性细胞因子测定与人细胞因子测定没有交叉反应。其通过将经消化的小 鼠肾脏与人细胞因子特异性膜一起孵育以及相反地将hAFSC与小鼠细胞因子特异性膜一 起孵育而证实。
[0247] 在所显示的时间点（24小时和48小时）将小鼠组织暴露于人细胞因子和小鼠细 胞因子活性中。当用这种方式考虑时，在早期细胞因子反应中，很显然所分析之组合细胞因 子水平大部分趋向于显著增加。因此，肌内注射甘油后24小时和48小时，当肾脏损伤达到 峰值时，未注射hAFSC的小鼠中所有4组细胞因子的表达水平均显著上升（多达5或6倍）。 但是，当向经甘油处理的小鼠注射hAFSC时，细胞因子水平的增加甚至明显更多，特别是24 小时时将小鼠和人细胞因子的水平相加。但是，在48小时时，组合细胞因子水平的这种趋 势发生逆转，以致大部分组合细胞因子水平相对于未接受hAFSC注射的肾脏来说显著降低 或者不再增加。此外，到48小时时，人与小鼠细胞因子的相对比例也发生逆转，细胞因子环 境中人组分相对较小。
[0248] 缩写
[0249] hAFSC:人羊水干细胞；ATN:急性肾小管坏死；H&E:苏木精和伊红；PAS:过碘酸希 夫；BUN :血尿氮素；AQP1 :水通道蛋白1 ;AQP2 :水通道蛋白2 ;⑶NF :胶质细胞源性神经营 养因子；ZO-1 :闭锁小环蛋白（Zona Occludens)_l :OCLN :紧密连接蛋白（Occuldin) ;THP : Tamm-Horsfall 蛋白；CDHOB :0B-钙粘蛋白；ACTB : 0 -肌动蛋白。
[0250] 过论
[0251] 急性肾小管坏死（ATN)造成肾脏肾小管上皮细胞的严重损伤，其可导致终末期肾 病（ESRD)。本文中证实了 hAFSC的保护性作用，所述hAFSC直接注射到经甘油诱导之ATN 的肾脏中。近些年来，一些研宄已经证实了干细胞（主要是来源于骨髓的间充质干细胞） 或肾脏特异性祖细胞（Lin，2007 ;A1-Awqati和Oliver，2006)改善肾脏损伤的潜在作用。 发现移植骨髓干细胞可以整合到受损肾脏中（Gupta等，2002 ;P〇uls〇m等，2001)。Morigi 等（2004, 2006)和Herrara等（2004)表明间充质干细胞（MSC)能够整合到受损的肾小管 中，并推测来源于骨髓的MSC具有分化成为肾脏上皮细胞的能力。但是，尚不清楚是否这 些细胞整合到受损的肾小管中具有任何生理作用。相反，其他小组已经表明，MSC具有通 过不同于整合和复制的机制修复受损肾脏功能的作用Ouffield等，2005 ;Lin等，2005)。 Bonventre等（2008)强调MSC在肾脏修复中的重要性，并且提出MSC可能通过作用于急性 肾脏损伤后的炎症过程来介导修复的可能性。
[0252] 已经对来源于羊水的新型干细胞群进行了表征（De Coppi等，2007)。这些c_kit+ 细胞在体外可以分化成来源于所有3个胚层的细胞，并且显示出与体内分化相似的潜能。 hAFSC具有整合到胚胎肾脏中的潜能，并参与肾脏发生的关键步骤，表明当置于合适的环境 中时，hAFSC可以被诱导成为肾脏（Perin等，2007)。
[0253] 在针对急性肾衰竭（nu/nu小鼠）的本研宄中，诱导ATN所需的甘油量比野生型小 鼠所需剂量高50% (数据未显示）。这表明与野生型小鼠相比，T缺陷的小鼠（裸鼠）可得 到保护而不受甘油-横纹肌溶解诱导的ATN的影响（Burne等，2001)。甘油诱导的ATN涉 及复杂的一系列事件，其中受损肌肉中释放的肌红蛋白破坏远端肾小管上皮细胞，导致管 型形成、血管收缩并且使得肾小球过滤压降低。凋亡细胞水平较高、肌酸酐和BUN水平增加 以及组织学分析证实了本模型中存在ATN。
[0254] 如萤光素酶检测所证明的，注射后存活之hAFSC的数量随时间而减少。尽管如此， 注射的hAFSC可以分化为肾小管上皮细胞。如利用特异性的人抗体和人引物进行免疫组化 和RT-PCR所测定的，注射后3周在受损肾脏中发现了 hAFSC，其定位于受损的肾小管中，并 且表达上皮细胞标志物。注射前这些标志物不存在于体外hAFSC中。
[0255] 还证实了注射的hAFSC还能够表达肾脏基因，例如PAX2和NPHS1，表明其可以定向 诱导分化为肾脏。此外，在某些情况下，注射的hAFSC细胞可以表达胶质细胞源性神经营养 因子（GDNF)，所述GDNF在肾脏的极早发育期时表达，通常不在成体肾脏中表达。
[0256] 还评估了 hAFSC是否可调节损伤后的肾脏功能，其反映为血清肌酸酐和BUN。当在 已确立的损伤急性期（注射甘油后48-72小时之间）中注射hAFSC时，肌酸酐和BUN的水 平没有降低（数据未显示）。这意味着当损伤已经发生时再注射hAFSC已太晚，而不能改 善损伤。相反，当在注射甘油的同一天将hAFSC注射到肾脏中时，没有观察到肌酸酐和BUN 的峰，强调了 AFSC具有潜在的保护性作用。因此，当注射得足够早（在此情形下与损伤同 时）时，hAFSC可以改善急性肾脏损伤。
[0257] 此外，组织学分析还证实，甘油注射后72小时，与经注射了甘油但未经hAFSC处理 的肾脏相比，经hAFSC注射的肾脏显示具有较少的受损肾小管。经AFSC处理的动物中肾小 管膜破坏较少并且无管型形成。因此，似乎注射hAFSC使得部分受损之肾小管上皮细胞增 殖加快，并且防止额外的细胞凋亡。该保护机制导致总体上更好地维持了肾小管结构，因此 避免了甘油诱导的ATN中通常观察到的BUN和肌酸酐增加。
[0258] 在急性肾脏损伤过程中，免疫反应特别地在前48小时发挥作用；受损肾脏上皮细 胞吸引白细胞，损伤时释放血管活性介质，肾小管上皮细胞产生促炎性细胞因子和趋化性 细胞因子（Bonventre等，2003)。最近，Bonventre等（2008)和Lin等（2007)推测骨髓干 细胞有助于肾脏修复的机制是通过削弱免疫反应，而不是通过干细胞整合到受损器官的细 胞中或者分化成为受损器官的细胞。Togen等（2005)表明，基于测定血清肌酸酐水平，注射 MSC可以早在24小时时抵御缺血性肾脏损伤。他们还推测，由于观察到的保护性反应时间 非常短，这些动物中的保护作用不是通过所注射MSC的整合和分化而实现的。
[0259] 本文中证实了注射hAFSC的有益作用在ATN过程的早期发生。因此，为了进一步 研宄hAFSC增强肾脏保护作用的潜在机制，测定了肾脏内的细胞因子，以便确定最初48小 时中当免疫系统在急性损伤期发挥极重要作用时，与未经处理的小鼠相比，经hAFSC处理 的小鼠中炎症细胞因子的模式是否发生总体变化。
[0260] 与未经处理的对照小鼠相比，仅经甘油注射的动物中显示肾脏细胞因子表达的显 著增加。这表明在急性ATN中，肾脏响应于细胞因子的强烈释放。与仅用甘油处理的肾脏 中测定的细胞因子水平相比，当用hAFSC注射小鼠时，细胞因子水平的增加甚至明显更多， 特别是在较早（24小时）的时间点。因此，hAFSC的功能可能是在ATN早期扩大肾脏细胞 因子环境。
[0261] 而且到48小时时，组合细胞因子水平中的这种趋势发生逆转，以致大部分组合细 胞因子水平相对于未接受hAFSC注射的肾脏来说显著减少，或者不再升高。此外，到48小 时时，人与小鼠细胞因子的相对比例也发生逆转，细胞因子环境中人组分的比例相对较小。
[0262] 除了几个例外，大部分人细胞因子对小鼠细胞也是具有活性的（Maliszewski等， 1998 ;Hu_Li 等，1987 ;Liu等，1995 ;Schwabe 等，1996 ;Kennedy 等，1996 ;De Haan 等，2000)， 因此人和小鼠细胞因子均很可能影响肾脏环境。这可能是有相关性的，因为很可能来源于 经注射之人细胞的细胞因子以及内源性小鼠细胞因子的复杂相互作用可在任何保护性作 用中发挥作用。
[0263] 因此，当将hAFSC直接注射到ATN小鼠模型的肾脏中时，其可以被招募，如先前在 两个肺损伤小鼠模型中所显示的（Carraro等，2008).因此，hAFSC可以驻留于损伤位点， 在那里其防止受损组织进一步损伤，并通过细胞因子介导的旁分泌机制加快修复。据信，由 hAFSC分泌的细胞因子与内源性小鼠细胞因子之间有协同作用，以促进并保持组织总体的 内稳态，并且与有助于使损伤消退的炎症环境相互作用，因而允许防止甘油诱导的ATN中 急性期的进程。
[0264] 此外，与24小时时（此时人细胞因子的相对比例非常高）的组合细胞因子水平相 比，将hAFSC注射到ATN肾脏后48小时时，细胞因子表达模式的大部分贡献来自于小鼠细 胞因子。这表明人细胞因子在肾脏响应于损伤的最早期发挥作用。
[0265] 总之，证实了hAFSC对在中毒性损伤中存活的固有肾脏细胞的营养作用，而不是 通过受损结构的直接再增殖，即使其显示出随时间分化为肾小管上皮细胞的潜能。如通过 肾小管结构损伤的更快消退以及正常化的肌酸酐和BUN水平所显示的，早期将hAFSC直接 注射到肾脏中显著改善ATN损伤。此外，数据表明hAFSC在非常早期的时间点具有免疫调 节作用，与内源性细胞因子产生的幅度相当。因此，hAFSC可以应用于治疗肾脏疾病的目的， 包括用于组织再生的多能细胞来源和全器官工程的可行替代品。
[0266] 以下实施方案内容对应于原申请的权利要求书：
[0267] 1.经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。
[0268] 2.来源于羊水之⑶24和0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞的克隆群。
[0269] 3.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、 TOGFR-a、足糖萼蛋白或其组合。
[0270] 4.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞能够被诱导分化成后肾细胞、足细胞、 基质源性间充质细胞或系膜细胞。
[0271] 5.实施方案1或2的细胞群，其中所述细胞能够在体内或离体被诱导分化。
[0272] 6. -种组合物，其包含实施方案1或2的来源于羊水的⑶24和0B-钙粘蛋白阳性 肾脏祖细胞群以及可药用载体和/或培养基。
[0273] 7. -种制备组合物的方法，包括将实施方案1或2中任一项的细胞或者由其分化 的后代细胞与载体混合。
[0274] 8.实施方案7的方法，其中所述载体是细胞培养基。
[0275] 9. 一种产生来源于羊水之肾脏祖细胞群的方法，包括从羊水样品中选择⑶24和 0B-钙粘蛋白阳性细胞。
[0276] 10.实施方案9的方法，其中所述选择利用抗CD24抗体和抗0B-钙粘蛋白抗体进 行。
[0277] 11.实施方案9或10的方法，另外针对E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkAJDGFR-a或 足糖粤蛋白进行选择。
[0278] 12.实施方案9或10的方法，其中所述选择通过荧光活化细胞分选或高梯度磁性 选择进行。
[0279] 13.由实施方案9或10的方法制备的经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和 0B-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞群。
[0280] 14. 一种使富含来源于羊水肾脏祖细胞的细胞群增殖的方法，包括：
[0281]a.从羊水样品中选择至少一个⑶24和0B-钙粘蛋白阳性细胞；
[0282] b.将所述至少一个细胞引入培养基中；和
[0283] c.使所述至少一个经选择的细胞在所述培养基中增殖。
[0284] 15.实施方案14的方法，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、 TOGFR-a或足糖萼蛋白。
[0285] 16. -种使经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞 群分化的方法，包括使所述细胞群与至少一种分化因子相接触。
[0286] 17. -种储存经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细 胞群的方法，包括从人对象获得羊水样品；从所述样品中分离CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾 脏祖细胞群；以及冷冻保存所述来源于羊水的CD24和OB-钙粘蛋白阳性肾脏祖细胞。
[0287] 18.实施方案16或17的方法，其中所述细胞还表达E-钙粘蛋白、肾病蛋白、TrkA、 TOGFR-a或足糖萼蛋白。
[0288] 19.一种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象施用治疗所述疾病或损 伤有效量的实施方案1或2的细胞或者由其分化的后代。
[0289] 20. -种预防或治疗肾脏疾病或损伤的方法，包括向对象施用治疗所述疾病或损 伤有效量的从羊水中分离和纯化的c-kit阳性细胞群或由其分化的后代。
[0290] 21.实施方案19或20的方法，其中所述对象是哺乳动物。
[0291] 22.实施方案21的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0292] 23.实施方案19或20的方法，其中所述细胞通过局部或全身注射施用。
[0293] 24.实施方案19或20的方法，其中所述疾病包括糖尿病性肾病、膜性肾病、局灶节 段性肾小球硬化症、膜增生性肾小球肾炎、弥漫增生性肾小球肾炎、膜性局灶节段性肾小球 硬化症、轻度肾小球病变、系膜增殖性肾小球肾炎、管内增殖性肾小球肾炎、系膜毛细血管 性肾小球肾炎、高密度沉积性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎、硬化性肾小球肾炎、缺血 性肾病、基于系统性疾病的肾小球疾病、基于血管疾病的肾小球疾病、基于代谢性疾病的肾 小球疾病、遗传性肾脏病变或移植肾小球病变。
[0294] 25.实施方案24的方法，其中所述遗传性肾脏病变导致奥尔波特综合征。
[0295] 26.实施方案19或20的方法，其中所述损伤是物理创伤的结果。
[0296] 27.由实施方案1或2的方法生产的经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和OB-钙 粘蛋白阳性肾脏祖细胞群，其用于医学治疗。
[0297] 28.实施方案27的用途，其中所述医学治疗是治疗由于损伤或疾病所致的肾脏伤 害。
[0298] 29.由实施方案1或2的方法生产的经分离和纯化的、来源于羊水的⑶24和OB-钙 粘蛋白阳性肾脏祖细胞群在制备用于治疗由于损伤或疾病导致肾脏损伤的药物中的用途。
[0299] 30.从羊水中分离和纯化的c-kit阳性细胞群或由其分化的后代在制备用于治疗 由于损伤或疾病所致肾脏伤害的药物中的用途。
[0300] 31.实施方案29或30的用途，其中