适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培养基及其制备和使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以一种培养基，具体的说是适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培养基及其 制备和使用方法。
【背景技术】
[0002] 绿僵菌sp.)是广谱的虫生真菌，侵入昆虫体壁后可在体腔内大 量繁殖，引起昆虫死亡。由于绿僵菌对昆虫的致病力强，对人、畜、作物无毒害，使用安全， 且具有较长的防效，故绿僵菌作为生物杀虫剂具有很好的应用前景。但由于在发酵方法、 剂型开发及环境制约等方面存在各种各样的问题，绿僵菌在害虫生物防治上的应用一度 受到很大限制，自1879年Mehhnhob首先大量繁殖绿僵菌防治奥地利金龟子 Herbst)以来，绿僵菌在害虫生物防治上的应用才逐步展开。依据瓶梗和分生 孢子的形状及排列方式，绿僵菌属包括七个种或变种：白色绿僵菌（I 3从_)、金龟子绿僵 菌小抱变种（I var. 金龟子绿僵菌大抱变种（i￡ var. ffiaj'ys)、双型抱绿僵菌（i￡ 黄绿绿僵菌黄绿变种（i￡ /yaraFiriofe var. /yaraFiriofe)、黄绿绿僵菌小抱变种（i￡ /yaraFiriofe var. 和戴氏绿僵菌 (i￡ teii)。目前，金龟子绿僵菌在害虫生物防治上应用较多。
[0003] 由于真菌杀虫剂具有触杀性、流行性、对环境安全和不易产生抗药性等特点，应用 绿僵菌防治害虫已取得一定成效。除防治奥地利金龟子外，应用绿僵菌防治地下害虫及非 洲蝗虫也已取得很大成绩。目前国内已登记注册的绿僵菌制剂可用来防治蝗虫、蜚蠊，在国 外有介壳虫、白粉虱、白蚁、蚊子、蜚蠊(美国)，蛴螬(德国)，甘蔗沫蝉、白粉虱（巴西)，甘蔗金 龟子、蝗虫、蚱蜢(澳大利亚）等。随着研究的深入和技术的进步，相信绿僵菌在害虫防治上 的应用范围会越来越宽。
[0004] 到目前为止，真菌杀虫剂主要剂型有粉剂、可湿性粉剂、油剂、干菌丝、微胶囊、颗 粒剂和漂浮剂等。已大面积应用的绿僵菌剂型主要是粉剂、干菌丝和油剂。由于生防真菌 最有效的侵染体是僵虫体表产生的气生分生孢子，所以上述制剂中除干菌丝和漂浮剂外， 其余几种制剂都是以绿僵菌的孢子粉为原药开发的。绿僵菌孢子粉的发酵生产在绿僵菌生 物杀虫剂的研制中具有重要的地位。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培 养基及其制备和使用方法，其具有原材料易于获得，制备方法简单易于掌握，培养的金龟子 绿僵菌，产孢量高，每克发酵原料（即生长固体发酵培养基上长出孢子的金龟子绿僵菌和固 体发酵培养基的混合物）可产生1 X 109以上个孢子；制备的孢子粉活孢率高，萌发率可达 95%左右。
[0006] 本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：提供适宜金龟子绿僵菌产孢的 发酵培养基，包括种子培养基和固体发酵培养基。
[0007] 其中所述种子培养基包括固体种子培养基和液体种子培养基；每升固体种子培养 基中含有质量浓度为20%马铃薯汁1000mL、葡萄糖20g、KH 2P04 3g、MgS04 1. 5g和琼脂20g， 余量为水；每升液体种子培养基中，含有蛋白胨10 g、蔗糖10 g、K2HP04 0. 3 g、MgS04 0. 3 g 和NaCl 0. 3 g，余量为水； 所述固体发酵培养基的成分为：麦麸、玉米糁和蒸馏水；其中麦麸和玉米糁的质量比 为1:1，蒸馏水的质量为麦麸和玉米糁总质量55-60%。所述固体发酵培养基的制备方法 为：取质量比为1:1的麦麸和玉米糁，混合均匀，放入三角瓶中，加入麦麸和玉米糁总质量 55-60%的蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，塞上棉塞，121°C蒸汽灭菌45min。
[0008] 以上所述的适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培养基的使用方法，包括以下步骤： 步骤一、将金龟子绿僵菌接种至固体种子培养基上，置于25°C恒温培养箱培养7~12d 后(待产生大量橄榄绿色孢子后)，在超净工作台上用灭菌的质量体积为0. 2%吐温-80洗下 固体种子培养基上的孢子，转移到灭菌的放有液体种子培养基和玻璃珠的三角瓶中，震荡 十分钟，使孢子分散均匀，然后置于25°C恒温摇床上150rpm震荡培养2~3d，所得发酵液即 为液体种子； 步骤二、在超净工作台上用移液枪吸取5 mL的液体种子，接入灭菌后的固体发酵培养 基上，在酒精灯火焰上方用玻璃棒搅拌均匀，置于25°C恒温培养箱中进行培养10天后结 束培养，即培养出产孢的金龟子绿僵菌；计算产孢子的量，制备金龟子绿僵菌孢子粉，并测 定萌发率。
[0009] 所述制备金龟子绿僵菌孢子粉的步骤为：将发酵后的固体发酵培养基在研钵中研 磨后，先用20目筛子过滤，再依次用60、100和60目筛子过滤，以尽可能除去发酵料和杂 质，最后用200目筛子过滤，收集金龟子绿僵菌所产生的孢子；将所收集的孢子放入烘箱中 干燥，温度设为25°C，干燥24小时后取出，即制备出金龟子绿僵菌孢子粉；所制备出的金龟 子绿僵菌孢子粉的萌发率为95%以上。
[0010] 有益效果是： 1、本发明所制备的适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培养基，种子培养基和固体培养基 有机结合，成分及配比恰当，适于金龟子绿僵菌的生长，产孢量高，每克发酵原料可产生 1X109以上个孢子；制备的孢子粉活孢率高，萌发率可达95%左右；且玉米糁和麦麸都是常 见的原料，易于获得，成本低廉，制备方法简易，易于掌握，解决了现有技术中存在的成本 高，产孢量低的问题。本发明的适宜金龟子绿僵菌产孢的发酵培养基在农作物害虫的生物 防治中有较好的应用前景。
[0011] 2、本发明的发酵培养方法，采用液固两项发酵法对金龟子绿僵菌进行培养，促进 其产孢；该方法廉价易得的原料、生产周期的短、生产效率提高、防止污染的程度高；其中 固体发酵培养基中采用的玉米糁较玉米粉密度小、通透性也好，又和玉米粉一样富含蛋白 质、淀粉、生物素等营养成分，所以玉米糁的添加比玉米粉更有利于为菌