专利名称：一株金龟子绿僵菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株金龟子绿僵菌及其应用。
背景技术：
甘鹿螟虫(sugarcane stem borer),俗称钻心虫，昆虫纲鳞翅目(Lepidoptera),是在广大蔗区普遍发生、危害严重的一类害虫。其中有螟蛾科昆虫50种，夜蛾科12种，小卷蛾科，木蠹蛾科和蝶蛾科各I种。该虫田间发生密度大,甘蔗从下种至砍收的整个生长期都受其危害，在种苗期受害后种苗不能萌芽出土；苗期螟虫幼虫危害甘蔗生长点造成枯心苗，使苗数和有效茎减少，其枯心率一般在10% 20%，严重的田块达到60%以上；在甘蔗生长中后期幼虫钻蛀啮食危害蔗茎，破坏蔗茎组织，影响甘蔗生长，遇上强风，蔗茎常从虫口处折断，且虫啮后留下的创口也是赤腐病等病原菌的侵入口，致使虫害与病害交叠发 生，不仅严重影响产量，也影响甘蔗的宿根性。目前，其防治主要靠化学农药，如呋喃丹、特丁磷、甲基异柳磷、克百威等，全是剧毒农药，不仅影响甘蔗本身的实用性，也严重影响到环境安全。而且长期使用这些化学农药，螟虫会产生抗药性，势必要进一步加大施药量，既增加成本，又加剧环境恶化，造成恶性循环。因此，用生物农药防治甘蔗螟虫就成为一条新的防治途径。目前国内外分离绿僵菌菌株防治对象大部分为蝗虫、棉铃虫、菜青虫、小菜蛾等，对于地上触杀性害虫，Bt等微生物农药也表现很强竞争力。可是，对于地下害虫、钻蛀性和粉蚧等难以直接触杀重要害虫，目前除了有些使用高毒农药有点效果，基本上都没有什么好方法。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一株金龟子绿僵菌。本发明所提供的金龟子绿僵菌是金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo. 5952。该菌种已于2012年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。本发明金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 在 28°C,在 PDA 培养基上的特征为，菌落初长白色，以后逐渐扩大，其上产生稀疏、暗绿色的分生孢子层并呈环状分布。菌丝分枝，有隔，无色光滑，宽2. 2 y m-3. 2 u m ;分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具
2-5个柱形的产孢细胞，大小为5. 2-9. OumX 2. 5-3. 2 y m，其上产生向基式的分生孢子链；单个分生孢子无色，柱形两端钝圆，大小为4. 5-6. 8 u mX I. 8-2. 9 u m0本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种杀虫菌剂。本发明所提供的杀虫菌剂，它的活性成分是上述金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213。所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213具体可为分生孢子或/和菌丝体。所述杀虫菌剂具体可用于防治下述I)-5)植物害虫中的五种、任四种、任三种、任两种或任一种害虫I)甘蔗螟虫；2)椰心叶甲(Brontispa longissima(Gestro)；3)东亚飞幢(Locusta migratoria manilensis Meyen)；4)蒸枝畴蟓(Tessaratoma papillosa Drury)；5)新菠萝灰粉阶(Dysmicoccus neobrevipes (Beardsley) ) 所述甘鹿螟虫具体可为条螟(Chilo venosatus)。 本发明金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213具体有如下的有益效果生产性状好、产孢能力强；同时对甘蔗螟虫杀虫活性强，二次侵染甘蔗螟虫效果好，对3 4龄甘蔗螟虫的LT5tl(致死中时)为7. 44天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，能有效控制甘鹿螟虫的种群数量。而且，金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213还对椰心叶甲、东亚飞蝗、荔枝椿象及菠萝灰粉蚧具有强致病力，具有较强二次侵染能力和稳定性，比较适合在热带、亚热带地区应用。菌种名称金龟子绿僵菌拉丁名Metarhiziumanisopliae菌株编号JF-6213保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年04月06日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5952下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的培养基每IL PDA培养基由如下物质制成200g土豆、20.(^葡萄糖、2(^琼脂和水。其中，用水将培养基定容至1000ml。PDA培养基的配制方法如下将切成小块的去皮土豆煮沸半小时，然后用纱布过滤，在滤液中，加入葡萄糖和琼脂，用水定容至IOOOmL,再121 °C湿热灭菌30min得到PDA培养基。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例I、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213的分离及鉴定I、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的分离称取中国海南乐东尖峰岭树林的表层土壤不同土壤样品各10g，分别装入装有20mL的无菌水的50mL无菌三角瓶中，搅拌混匀后静置片刻，待土壤沉淀后，吸取5mL上清液至IOmL无菌离心管中备用。取准备好的已灭菌的燕麦琼脂培养基，50°C左右时加入34mg/mL的氯霉素溶液，使培养基中氯霉素浓度达到约500mg/L，摇匀后将燕麦琼脂培养基倒于25CmX15CmX3Cm的无菌不锈钢方盘中，每个方盘大约倒200mL培养基。待培养基冷却凝固后，各取4mL不同土壤样品上清液用涂棒均匀涂布接种于不同方盘上，接种完毕盖上无菌玻璃板，放入28°C的恒温培养箱中培养。得到金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213。2、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的鉴定(I)形态学鉴定将分离纯化到的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213菌株接种在PDA平板上，28°C观察菌落形态特征，产孢结构和孢子形状与大小。结果显示在PDA培养基上菌落初长白色，以后逐渐扩大，其上产生稀疏、暗绿色的分生孢子层并呈环状分布。菌丝 分枝，有隔，无色光滑，宽2. 2 y m-3. 2 u m ;分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2_5个柱形的产孢细胞，大小为5. 2-9. OumX 2. 5-3. 2 y m，其上产生向基式的分生孢子链；单个分生孢子无色，柱形两端钝圆，大小为4. 5-6. 8 V- mX I. 8-2. 9 u m0(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定无菌条件下，配制金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF_6213孢子悬浮液，取500 ii L孢子悬浮液接种于装有50mL液体葡萄糖蛋白胨液体培养基(2%葡萄糖和1%蛋白胨)的三角瓶中，置于200转/min的摇床上28°C恒温下培养。培养3_5d后，采用真空抽滤方法收集菌丝体，并将菌丝体保存于_20°C冰箱中备用。菌丝体用液氮研磨成粉末状后，采用SDS法提取基因组DNA。提取的DNA经0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度仪测ODa3ci值后，将样品稀释至约IOng/ ii L备用。以总DNA为模板，采用Curran等设计的ITS1-5. 8S-ITS2区扩增引物进行PCR扩增，所用引物为 TW81 :5 ’ -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC- ‘ 3 和 AB21:5 ’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-‘3，产生547bp扩增条带。PCR反应在PCR仪上的反应程序94°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸lmin，进行35个循环；最后72°C延伸lOmin。将扩增产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，由宝生物工程(大连)有限公司测序部测序。测序结果表明金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213的ITS1-5. 8S-ITS2区域的序列如序列表中的序列I所示。金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 已于 2012 年 04 月 06 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5952。3、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 的抗逆特性金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213有较强的抗逆性，在pH值4 9范围内的PDA培养基中均可以生长，其最适生长pH值为8 ;在似(1浓度为0. 05 0. 25mol/L条件下，NaCl对菌株JF-6213的生长有一定的促进作用，浓度越大促进越明显，有较强的耐盐能力；高温条件及紫外光对绿僵菌孢子萌发有较强的抑制作用。实施例2、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 CGMCC No. 5952 对甘蔗螟虫室内杀虫活性的测定
将分离纯化到的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae) JF-6213 CGMCCNo. 5952菌株接种在PDA平板上在28°C培养8_9天；收集在PDA平板上培养的成熟孢子，用0. 05%(0. 05g/100ml)吐温-80水溶液分散，配制成终浓度为I X IO8个孢子/ml( I X 108cfu/ml)的悬浮液，该悬浮液即为金龟子绿僵菌菌剂。实验设两个处理，分别为金龟子绿僵菌菌剂组(简称菌剂组)和对照组。每个处理各3个重复，每个重复各设2株甘蔗苗。将体形大小相近、健康的3 4龄甘鹿螟虫(条螟(Chilo venosatus)) 30只(3龄23只、4龄7只)接于2株分蘖初期六片叶的甘蔗苗上及甘蔗苗附近土壤中，该甘蔗苗种在塑料盒(15cmX IOcmX 5cm)中，每个塑料盒2株。然后将甘蔗苗随机分为菌剂组和对照组。菌剂组的处理方法如下用手持喷雾器喷施金龟子绿僵菌菌剂，均匀喷雾至蔗苗滴水，重点喷施蔗苗喇叭口和叶鞘处。对照组用0. 05% (0. 05g/100ml)吐温-80水溶液替代金龟子绿僵菌菌剂进行同样的喷雾。喷完在25-32°C培养，观察15天，隔天记录死虫数，计算存活率，经SPSS11. 5软件统计分析得到金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae) JF-6213 CGMCCNo. 5952对3 4龄甘蔗螟虫的LT5tl(致死中时)为7. 44天(表I)。表I.甘蔗螟虫的死亡情况
权利要求
1.金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)，其特征在于所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的菌株号为JF-6213，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5952。
2.权利要求I所述的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用。
3.—种杀虫菌剂，它的活性成分是权利要求I所述的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于所述金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)为分生孢子或/和菌丝体。
5.根据权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于所述杀虫菌剂用于防治下述I)-5)植物害虫中的五种、四种、三种、两种或一种害虫 1)甘蔗螟虫； 2)椰心叶甲(Brontispalongissima(Gestro)； 3)东亚飞虫皇(Locustamigratoria manilensis Meyen)； 4)蒸枝虫舂蟓(Tessaratomapapillosa Drury)； 5)新菠萝灰粉阶(Dysmicoccusneobrevipes (Beardsley))。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于所述甘蔗螟虫为条螟(Chilovenosatus)0
7.权利要求I所述的金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)在制备植物杀虫剂中的应用。
8.权利要求3或4所述的菌剂在制备植物杀虫剂中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述植物杀虫剂的靶标害虫为下述I) -5)植物害虫中的五种、四种、三种、两种或一种害虫 1)甘蔗螟虫； 2)椰心叶甲(Brontispalongissima(Gestro)； 3)东亚飞虫皇(Locustamigratoria manilensis Meyen)； 4)蒸枝虫舂蟓(Tessaratomapapillosa Drury)； 5)新菠萝灰粉阶(Dysmicoccusneobrevipes (Beardsley))。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述甘蔗螟虫为条螟(Chilovenosatus)0
全文摘要
本发明公开了一株金龟子绿僵菌及其应用。本发明所提供的金龟子绿僵菌是金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5952。该菌株生产性状好、产孢能力强；同时对甘蔗螟虫杀虫活性强，二次侵染甘蔗螟虫效果好，对3～4龄甘蔗螟虫的LT50(致死中时)为7.44天。利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，能有效控制甘蔗螟虫的种群数量。而且，金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)JF-6213还对椰心叶甲、东亚飞蝗、荔枝椿象及菠萝灰粉蚧具有强致病力，具有较强二次侵染能力和稳定性，比较适合在热带、亚热带地区应用。
文档编号C12N1/14GK102776130SQ20121027429
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者刘磊, 杨腊英, 梁昌聪, 郭立佳, 黄俊生 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所