专利名称：一种高产山梨酮的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种高产山梨酮的G. oxydans工程菌及其构建方法和应用,采用分子生物学的方法引入山梨糖脱氢酶(SDH)基因，从而实现代谢山梨醇生产山梨酮，属于遗传工程领域。
背景技术：
维生素C(Vitamin C, VC),又称为L-抗坏血酸(L_ascorbic acid),是一种重要的有机酸，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中。由于一直未能发现直接合成维生素C的微生物，所以精力主要集中在利用微生物发酵生产其中间产物，特别是其直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2_KLG)。1972年，我国科学家发明了维生素C 二步发酵法，由于工艺极大简化、得率和安全性均得到较大提升，很快在全国得到推 广，但是在第二步混合菌发酵体系中，执行糖酸转化的微生物只有小菌，小菌单独生长很困难，需要与大菌共同培养才能正常生长，工艺复杂，影响因素较多，难以精确控制，如何简化当前的二步发酵工艺是一个迫切需要解决的问题。基因工程技术改造G. oxydans生产维生素C中间产物山梨酮国内未见有相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问在于提供一种高产山梨酮的G. oxydans工程菌，所述工程菌通过启动子tufB表达sdh基因。所述sdh基因核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种可用于山梨酮高效生产的质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。所述sdh基因连接到革兰氏阴性菌广泛宿主穿梭质粒载体pBBRMCS-2上(Fournewderivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS，carryingdifferent antibiotic-resistance cassettes)。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产山梨酮的G. oxydans基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题，本发明的具体方案为I)根据本实验室对K. vulgare WSH-001 (来源于江苏江山制药有限公司)的全基因组测序结果中注释的sdh基因合成sdh基因；根据G. oxydans WSH-003基因组信息合成其延伸因子启动子tufB基因。2)将sdh、tufB与pBBRMCS-2载体连接得到重组表达载体；3)将得到的重组表达载体转化G. oxydans 621H后得到重组菌株。本发明所要解决的另一个技术问题在于G. oxydans基因工程菌山梨酮生产中的应用，具体方法为将所述工程菌G. oxydans从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中，30° C、200rpm培养24h后按15%的接种量接种于发酵培养基，30° C、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h。种子和斜面培养基(g/L):山梨醇15，酵母膏O. 6，pH 4. 8 5. 1，琼脂20 (斜面培养基)，pH 7.0,121° C灭菌15min，卡那霉素终浓度50 μ g/mL。发酵培养基(g/L):山梨醇25，酵母膏O. 2，初始pH 5. I 5. 4，121° C灭菌15min,卡那霉素终浓度50 μ g/mL。山梨醇、山梨酮含量测定液相色谱(HPLC)发酵样品用流动相十倍稀释,O. 45 μ m滤膜过滤。Agilent IlOOsystem, RioRad公 司 Aminex HPX-87H 色谱柱；流动相2. 75 μ mol/L 浓硫酸；柱温:35。C ;流速0. 6mL/min ；进样量5 μ L ;检测器示差折光检测器。本发明通过基因工程改造，将来源于K. vulgare WSH-001的sdh基因克隆到G. oxydans621H中，并将G. oxydans WSH-003中延伸因子的启动子连接到sdh基因前，获得了一株利用山梨醇生产山梨酮的G. oxydans工程菌,为构建G. oxydans 一步发酵工程菌生产维生素C直接前体2-KLG提供了理论基础，从而解除小菌对伴生菌依赖的问题，简化维生素C生产工艺，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。利用本发明提供的高产山梨酮基因工程菌发酵生产山梨酮，其产量可达到72g/L。
具体实施例方式实施例I表达载体的构建 将本实验室对K. vulgare WSH-001的全基因组测序结果中注释的sdh和G. oxydans WSH-003中延伸因子的启动子tufB扩增后克隆到pMD19_T载体中，挑取阳性转化子测序验证，将正确的转化子培养提取质粒，与革兰氏阴性菌广泛宿主穿梭质粒载体pBBRMCS-2分别经Xho I及Hind III双酶切后连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，挑取转化子培养，提取质粒经Xho I及Hind III酶切验证，出现1858bp的条带，证明已经成功构建表达载体pBBRMCS-sdh。再将测序正确的pMD 19-T-tufB和pBBRMCS_sdh经Kpn I及Xho I双酶切后连接，转化E. coli JM109，挑取转化子培养，提取质粒分别经Kpn
I、Xho I和Xho I、HindIII双酶切验证，出现1858bp和500bp的条带，证明已经成功构建表达载体 pBBRMCS-tufB-sdh。实施例2G. oxydans工程菌的构建将上述构建好的大肠杆菌重组菌E. coli/pBBRMCS-tufB-sdh,辅助菌coli/PRK2013 (ATCC保藏编号37159)和受体菌G. oxydans 621H别培养至对数期，按2:1:1的比例混合后离心，用生理盐水洗涤菌体沉淀，重悬于100 μ L生理盐水，将菌悬液全部涂布到山梨醇平板的无菌滤膜上，培养12h，刮取菌体作适当稀释后，涂布到终浓度50μ g/mL的头孢西丁钠和50 μ g/mL的卡那霉素的选择性平板上，挑取阳性转移子进行PCR验证，并将阳性转移子培养后提取质粒回转E. coli JM109，提取质粒分别经Kpn I, Xho I和Xho I、Hind III双酶切验证，出现1858bp和500bp的条带，证明成功构建重组菌株G. oxydans/pBBRMCS-tufB-sdh。实施例3发酵生产山梨酮
种子和斜面培养基(g/L):山梨醇20，酵母膏2，pH 4. 8 5. 1，琼脂20 (斜面培养基)，pH 7.0，121。C灭菌15min，卡那霉素终浓度50 μ g/mL。发酵培养基(g/L):山梨醇80，酵母膏5，初始pH 5. I 5. 4，121° C灭菌15min，卡那霉素终浓度50 μ g/mL。培养条件从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中，30° C、200rpm培养24h后按15%接种量接种于发酵培养基，30° C、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h，山梨酮产量为72g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种高产山梨酮的氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)工程菌，其特征在于通过启动子tufB表达外源sdh基因。
2.根据权利要求I所述的工程菌，其特征在于所述sdh基因核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
3.一种促进表达生产山梨酮的质粒，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.权利要求I所述工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤 1)设计引物分别克隆sdh和tufB； 2)将sdh、tufB克隆到重组表达载体； 3)将重组表达载体转化到G.oxydans 621H后得到重组菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述重组表达载体为pBBRMCS-2。
6.权利要求I所述工程菌应用于山梨酮生产。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于将所述工程菌在30°C、200rpm培养24h后按15%的接种量接种于发酵培养基，30° C、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h。
全文摘要
本发明公开了一种产维生素C合成中间体山梨酮的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术，将来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶基因(sdh)克隆到氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)中，获得了一株利用山梨醇生产山梨酮的G.oxydans工程菌。G.oxydans WSH-003是二步发酵法生产2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)过程中第一步发酵工业菌株，由江苏江山制药有限公司提供。将sdh克隆到G.oxydans中，实现了从D-山梨醇到维生素C合成中间体山梨酮的转化，为进一步构建一步发酵工程菌生产维生素C直接前体2-KLG奠定了基础，山梨酮的产量可达72g/L，具有很好的应用前景。
文档编号C12R1/01GK102851252SQ20121027417
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者陈坚, 周景文, 高丽丽, 刘杰, 堵国成 申请人:江南大学