一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治领域，涉及一株绿僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一株 对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 油茶（Oil-tea Camellia)是我国特有的木本食用油料树种，主要分布在长江流域 及其以南的14个省（市、区）。油茶象Ci/rcWio Chevrolat又名茶籽象甲、油 茶中华实象，隶属于象虫科象甲属，是危害油茶果实最为严重的一种害虫，也是全国林业危 险性有害生物（国家林业局，2013)。该虫幼虫在果内蛀食果仁，使茶籽严重减产，并且影响 茶油品质。据调查，油茶象危害后落果率可达到69. 2%。油茶作为食用油料树种，探寻害虫 生物防治，尽量少用或避免使用化学农药已成为生产上的迫切需要。
[0003] 绿僵菌属虫生真菌，目前已知能寄生8个目42个科的200多种昆虫，以及螨类和 线虫等。绿僵菌具有适应性强、在土壤中和林间能长期宿存、致病周期短、对人畜无毒害以 及对环境友好等特点。金龟子绿僵菌aflisop/iae)是应用最为广泛的绿僵 菌种类，据不完全统计，近年来世界各地用金龟子绿僵菌对近百种森林、农作物及卫生害 虫进行了防治试验；特别是作为一种防治地下害虫较为有效的真菌杀虫剂，其在防治中已 有应用实践，取得了良好的效果。油茶象虽然是蛀果害虫，但其老熟幼虫出果后在土壤中 滞育时间长达一年以上直至化蛹羽化为成虫出土。据检索，目前利用虫生真菌防治油茶 象幼虫的研究尚未见报道，为此，筛选出对其幼虫致病力强的金龟子绿僵菌 菌株，为生产上提供优良菌株和菌剂具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其 应用。
[0005] 一株金龟子绿僵菌，命名为金龟子绿僵菌 菌株，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC),地址：北京市卓月 阳区北辰西路I号院3号；保藏编号：CGMCC No. 9780。
[0006] 该金龟子绿僵菌菌株（JfciarAizi應FJMa201101具有以下特征： 在PPDA培养基上25 土 1°C下生长5天，菌落直径18 mm，15天达58mm。菌落初期为白 色，质地绒毛状或棉絮状，逐渐扩大；其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布，粉末状。菌丝 分枝，有格，无色光滑，宽2. 3 μ m~3. 2 μ m，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状 的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为 4. 5~6· 8 μ mX L 8-2. 9 μ m。最佳生长温度范围为23~28°C。
[0007] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治油茶象幼虫的菌株和菌剂。
[0008] 本发明所提供的菌剂具体可分为分生孢子悬浮液或孢子粉剂。其中孢子悬浮液的 浓度为IO7孢子/ml。分生孢子粉剂含量为60~80亿孢子/克菌剂。
[0009] 本发明所提供菌剂的有效成分是上述金龟子绿僵菌aflisoWiae) FJMa201101的分生孢子。
[0010] 本发明所提供的或所述菌剂可用于防治油茶象幼虫。
[0011] 本发明提供的金龟子绿僵菌菌株（JfciarAizi腫FJMa201101具有如 下有益效果： 生产性状好，产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力强，采用浓度为IO7孢子/ml的 孢子悬浮液浸渍法接种其LT5tl为1. 65 d，感染率为86. 6% ;采用孢子拌土法(接种量为10 5 孢子/g 土）LT5tl为2. lld，感染率为94. 5%。利用该菌株生产的菌剂，能显著降低油茶象幼 虫林间种群数量。同时该菌株能在土壤中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合在亚热 带地区的油茶象发生林分中应用。
[0012] 本发明的优点在于：为油茶象幼虫防治提供了高致病力菌株和菌剂；同时绿僵菌 具有在土壤中和林间能长期宿存、对人畜无毒害以及对环境友好等特点，本发明的高效金 龟子绿僵菌菌株和菌剂可解决以往油茶象采用化学防治带来的环境污染、农药残留等问 题。本发明具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0013] 图1为金龟子绿僵菌FJMa201101菌株在PPDA培养基上25±1°C下培养15天的 菌落形态图。
[0014] 图2为油茶象幼虫被金龟子绿僵菌FJMa201101感染症状。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例，对本发明的【具体实施方式】进行详细描述，这些实施例用于 理解而不是限制本发明的范围。
[0016] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017] 下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0018] 下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写， 其具体配方为每IOOOml水中含有马铃薯200g (切块煮熟后过滤，取滤液)，葡萄糖20g，蛋 白胨l〇g，琼脂20g。
[0019] 实施例1 金龟子绿僵菌的鉴定 形态学鉴定 将分离纯化的金龟子绿僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上于25 ± 1°C条件 下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12 天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特 征。该菌株菌落质地棉絮状，菌落初期为白色，逐渐扩大，其上产生暗绿色分生孢子并成环 状分布。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2. 3 μ m~3. 2 μ m，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端 具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表 面光滑，大小为 4. 5~6· 8 μ mX 1. 8-2. 9 μ m。
[0020] 菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定 利用金龟子绿僵菌afliso/^/iaeOFJMaZOllOl菌株的菌丝体提取总DNA， 然后以所提取的DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5(由上海生工生物工程 股份有限公司合成）进行PCR扩增，2XTaq PCR MasterMix (含染料）12. 5μ?;引物ITS4/ ITS5 (10 Mmol/L)各 lPL;ddH20 9·5μ?;模板 DNA ?μ?。PCR 反应程序：95°C预变性 4min， 94°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸40s，进行35个循环，最后72°C延伸7min，用无菌水 代替模板作阴性对照。PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA -ITS区域PCR扩增产物 符合测序要求后，将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送至钼尚生物技术(上海）有限公司 进行序列测定。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI)基因数据库的绿僵菌菌 株序列进行比对。
[0021] 扩增引物序列： ITS4: 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3' 。
[0022] ITS5 :5,-GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG-3'。
【主权项】
1. 一种金龟子绿僵菌，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae)FJMa201101，该菌株已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No. 9780。
2. -种杀虫菌剂，其特征在于所述的杀虫菌剂含有权利要求1所述的金龟子绿僵菌 (Metarhizium anisopliae)FJMa201101 所产生的分生抱子。
3. 按照权利要求2所述的杀虫菌剂，其特征在于其剂型为分生孢子悬浮液或粉剂。
4. 权利要求1所述的一株金龟子绿僵菌在防治油茶象幼虫中的应用。
【专利摘要】本发明公开一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用。发明所提供的金龟子绿僵菌菌株命名为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9780。该菌株生长速度快、产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力高，以107孢子/mL的孢子悬浮液接种后对油茶象幼虫的LT50（致死中时）为1.65天。利用该菌株生产的真菌制剂，对油茶象的防治效果好，能有效控制油茶象种群密度，是一株在油茶象的防治上具有潜在价值的生防菌株，对促进油茶优质丰产具有积极意义。CGMCC No.978020141027
【IPC分类】C12N1-14, A01N63-04, C12R1-645, A01P7-04
【公开号】CN104560740
【申请号】CN201510055121
【发明人】何学友, 蔡守平, 杨希, 曾丽琼, 黄金水
【申请人】福建省林业科学研究院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月3日