专利名称：一种利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用微生物发酵生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，具体的，本发明涉及一种利用发酵工业废弃菌渣经固态发酵同时生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法。
背景技术：
微生物杀虫剂具有对人畜安全、对天敌昆虫无害、选择性高、对环境影响小、不易产生抗药性等特点而受到越来越多的重视。现在普遍强调使用昆虫病原体作为杀虫剂。金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一种广谱虫生真菌，利用其孢子可作为微生物杀虫剂，具有寄主广泛、致病力强、低害、后效期长等特点，具有广泛的应用前景。
目前关于金龟子发酵生产孢子的报道较多，例如《昆虫天敌》2004(1)，3～5报道吴振强金龟子绿僵菌—固两步发酵工艺；《科技情报开发与经济》2004(12)，219～221报道液体发酵金龟子绿僵菌；《应用与环境生物学报》2004(2)，223～225报道金龟子绿僵菌固体培养基发酵生产条件的筛选。这些发酵生产方式普遍采用黄豆粉等粮食作为培养基、产品单一，未能有效利用真菌发酵生产条件，经济价值不明显。壳聚糖是天然高分子化合物，具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，在化工、食品、环保、医药卫生、农业等方面得到广泛的应用。工业生产壳聚糖的主要是用虾、蟹等甲壳动物的外壳，先提取出甲壳素，而后通过高浓度碱在高温下脱乙酰得到壳聚糖。目前公开文献报道，发酵工业中广泛应用的根霉菌菌丝体中含有天然壳聚糖，例如，《食品与发酵工业》2004(12)，66～70报道张涛等从日本根霉菌丝体中提取壳聚糖的研究；《化学与生物工程》2003(6)，31～33报道王荣等从总状毛霉和根霉细胞壁中提取壳聚糖的研究；《华侨大学学报(自然科学版)》1995(2)，323～327报道陈世年从米根霉细胞壁中提取出壳聚糖。这些根霉菌丝体中不但含有天然壳聚糖，同时有大量蛋白质，有较好应用和经济价值。
壳寡糖不仅具有水溶性好、易吸收等优点，近年来更是发现，壳聚糖的降解产物低分子量壳寡聚糖(如五糖、六糖)具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，使其在医药领域有着广泛的应用前景。利用专一性的壳聚糖酶水解壳聚糖，反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物，壳寡糖产量高且质量稳定，是一种较为理想的大规模生产壳寡糖的制备方法。
公开文献报道，可产生壳聚糖酶的微生物有白僵菌(Beauveriabassiana)、青霉菌(Penicillum)、链霉菌(Streptomyces)等，它们生产壳聚糖酶所需培养条件复杂，产酶活性低。目前公开文献报道的壳聚糖酶制备工艺均采用液态发酵，例如，《食品与发酵工业》2004(2)，57～61报道陈小娥等采用150r/min，30℃摇瓶发酵一株曲霉，粗酶液中壳聚糖酶活力为197mu/mL；《郑州工程学院学报》2001(4)，19～23报道蔡静平等采用120r/min，30℃摇瓶发酵一株假单胞菌，粗酶液中壳聚糖酶活力为117mu/mL。以上工艺均采用成品壳聚糖做为壳聚糖酶的诱导剂，生产成本高，能耗大，初产品活性成分浓度低，导致商品壳聚糖酶价格居高不下，难以大规模应用于工业化生产壳寡聚糖。
现代社会能源紧张，水资源紧缺，液态发酵耗能高，需要大量淡水的缺点日益突出。固态发酵在我国有着悠久的应用历史，其具有耗能低，污染小，成本低廉，易于推广等优点。至今为止，没有关于利用菌丝体中天然壳聚糖作为诱导剂生产壳聚糖酶，以及金龟子绿僵菌生产壳聚糖酶及固态发酵联合生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的报道。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种利用金龟子绿僵菌经固态发酵联合生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法。发酵工业中废弃的根霉菌的菌丝体中含有大量蛋白质和部分壳聚糖。本发明利用根霉菌渣作为发酵的主要氮源和壳聚糖酶诱导剂，使金龟子绿僵菌固态发酵的同时产生壳聚糖酶。本发明发酵用原料易得、降低发酵中对粮食的需求，生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、有效的利用了工业废渣，具有较高的经济和实用价值。
本发明的具体技术方案来如下一种利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，其特征在于包括如下工艺步骤A、菌种保藏将金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌种接种在PDA斜面培养基上，于4℃保存，每半年转接一次。该斜面培养基的配方为(g/L)土豆汁20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，MgSO4·7H2O0.5％，K2HPO40.3％。
所述金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)可以在中国科学院微生物研究所的分网站(中国微生物信息网络中国微生物菌种目录)上查找到，其为公知公用的菌种。本发明菌株为从中科院微生物所直接购买的。
B、种子培养将上述PDA斜面培养基于115℃灭菌15分钟后接种于另一PDA斜面培养基上，并将其作为种子培养基于25℃～28℃培养7～10天，用灭菌好的0.5％的Tween-80溶液洗下孢子，即得孢子悬液。
C、固态发酵选取麸皮、根霉干燥菌渣为培养基的主要原料。其中，固体营养基质按重量计包括如下组分麸皮10～30份、根霉干燥菌渣粉末30～60份、木屑10～30份、缓冲液50～100份、MgCl20.01～0.2份、KH2PO40.01～0.2份，CuSO40.001～0.05份，ZnSO40.01～0.2份；将上述固态营养基质混合均匀，并于培养基115℃灭菌15分钟后，接种孢子悬液，接种量为固态培养基总重量的5～15％，在相对湿度为60～75％、温度为25～28℃的条件下，静态培养5天。
所述根霉干燥菌渣为发酵工业废弃的根霉菌的菌丝体，经120℃干燥至恒重后，磨碎后过60目筛即得。
所述缓冲溶液为浓度为20～200mmol/L，pH为3～6的柠檬酸—柠檬酸三钠缓冲溶液。
D、孢子和酶的分离将经固态发酵后的培养物过筛收集分生孢子后，然后向剩余培养物中加入10倍重量的水或者pH值为3～6的缓冲溶液，机械搅拌1小时后，压滤除渣，所得上清液即为壳聚糖酶液。
所述缓冲溶液为浓度为20～200mmol/L，pH为3～6的柠檬酸—柠檬酸三钠缓冲溶液。
本发明壳聚糖酶活力测定采用PMAB法。一个酶活力单位(U)定义为每分钟释放1μg GlcN-HCl(盐酸氨基葡萄糖)还原糖所需要的酶量。
本发明原料易得、生产成本低廉、操作简单，既能生产微生物杀虫剂，同时有效利用了发酵工业废弃的根霉菌的菌丝体，减少了工业废弃物。而且还获得了壳聚糖，具有较高的经济和实用价值。
具体实施例方式
实施例一(1)将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在25℃培养7天，产生大量黄绿色分生孢子。用灭菌好的0.5％的Tween-80溶液洗下孢子，玻璃棉过滤除去菌丝体后，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡至孢子分散。用血球计数板计数调整孢子浓度为105～106个孢子/ml，即得孢子悬液。
(2)将固体营养基质麸皮10克、根霉干燥菌渣粉末30克、木屑15克、缓冲液75克、MgCl20.05克、KH2PO40.05克，CuSO40.001克、ZnSO40.01克，混合均匀，115℃灭菌15分钟后，放入250ml三角瓶中混合均匀，接种孢子悬液。在相对湿度60～75％、26℃的条件下，静态培养5天，即得产孢量为2.0×109个孢子/g干培养基。
(3)过筛收集分生孢子后，向剩余培养物加入100ml水，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为57.5U/g干培养基。
实施例二(1)将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养8天，产生大量黄绿色分生孢子。用灭菌好的0.5％的Tween-80溶液洗下孢子，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡3小时至孢子分散。纱布过滤除去菌丝体后，调整孢子浓度为105～106个孢子/ml，即得孢子悬液。
(2)将固体营养基质麸皮12克、根霉干燥菌渣粉末40克、木屑20克、缓冲液100克、MgCl20.02克、KH2PO40.06克、CuSO40.002克、ZnSO40.02克，合均匀115℃灭菌15分钟后，放入500ml三角瓶中混合均匀，接入孢子悬液。在相对湿度为60～75％的条件下，在27℃静态培养5天。产孢量为3.5×109个孢子/g干培养基。
(3)过筛收集分生孢子后，向剩余培养物加入100ml水，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为63U/g干培养基。
实施例三(1)将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在28℃培养10天，产生大量绿色分生孢子。用灭菌好的0.5％的Tween-80溶液洗下孢子，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时至孢子分散。玻璃棉过滤除去菌丝体后，调整孢子浓度为105～106个孢子/ml，即得孢子悬液。
(2)将固体营养基质麸皮20克、根霉干燥菌渣粉末70克、木屑45克、缓冲液170克、MgCl20.1克、KH2PO40.16克、CuSO40.005克、ZnSO40.12克、混合均匀，115℃灭菌15分钟后，放入1000ml三角瓶中混合均匀，接入孢子悬液。在相对湿度为60～75％的条件下，在28℃静态培养120h，产孢量为4.0×109个孢子/g干培养基。
(3)过筛收集分生孢子后，向剩余培养物加入100ml柠檬酸—柠檬酸三钠缓冲溶液(pH5.5，20mmol/L)，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为73.5U/g干培养基。
权利要求
1.一种利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，其特征在于包括如下工艺步骤A、菌种保藏将金龟子绿僵菌(Metarhizium guizhouense)菌种于4℃接种在PDA斜面培养基上，每半年转接一次，该斜面培养基的配方按g/L为土豆汁20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，MgSO4·7H2O0.5％，K2HPO40.3％；B、种子培养将上述PDA斜面培养基于115℃灭菌15分钟后接种于另一PDA斜面培养基上，并将其作为种子培养基于25℃～29℃培养7～10天，用灭菌好的0.5％的Tween-80溶液洗下孢子，即得孢子悬液；C、固态发酵选取麸皮、根霉干燥菌渣为培养基的主要原料，其中，固态营养基质按重量计包括如下组分麸皮10～30份、根霉干燥菌渣粉末30～60份、木屑10～30份、缓冲液50～100份、MgCl20.01～0.2份、KH2PO40.01～0.2份、CuSO40.001～0.05份、ZnSO40.01～0.2份；将上述固态营养基质混合均匀，并于培养基115℃灭菌15分钟后，接种孢子悬液，接种量为固态培养基总重量的5～15％，在相对湿度为60～75％、温度为25～28℃的条件下，静态培养5天；D、孢子和酶的分离将经固态发酵后的培养物过筛收集分生孢子后，然后向剩余培养物中加入10倍重量的水或者pH值为4～8的缓冲溶液，机械搅拌1小时后，压滤除渣，所得上清液即为壳聚糖酶液。
2.如权利要求1所述的利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，其特征在于所述根霉干燥菌渣为发酵培养基的主要氮源和壳聚糖酶诱导剂。
3.如权利要求1所述的利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，其特征在于所述根霉干燥菌渣为发酵工业废弃的根霉菌的菌丝体，经120℃干燥至恒重后，磨碎后过60目筛即得。
4.如权利要求1所述的利用废弃菌渣生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，其特征在于所述缓冲溶液为浓度20～200mmol/L，pH3～6的柠檬酸-柠檬酸三钠溶液。
全文摘要
本发明公开了一种利用发酵工业废弃菌渣，经固态发酵同时生产微生物杀虫剂和壳聚糖酶的方法，它是以麸皮、根霉干燥菌渣为培养基的主要原料，并以根霉干燥菌渣为培养基中主要氮源和壳聚糖酶诱导剂，同时辅以木屑，接种金龟子绿僵菌的孢子悬液后，于相对湿度为60～75％、温度为25～28℃的条件下，静态培养5天，再将发酵后的培养物过筛收集分生孢子，剩余培养物加水或缓冲溶液经压滤除渣即获壳聚糖酶溶液。本发明发酵用原料易得、降低了发酵中对粮食的需求，生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、有效地利用了工业废渣，具有较高的经济和实用价值。
文档编号C12N9/24GK1813542SQ200610020179
公开日2006年8月9日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者张涛 申请人:成都医学院