一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特点是：1）准确称取固体或液体试样备用；准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为Ⅰ液；准确移取适量Ⅰ液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Ⅱ液；2）以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，绘制工作曲线；3）准确移取Ⅱ液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据吸光值计算壳聚糖含量。本发明确保了检测结果的真实可靠性，确定了壳聚糖的最佳水解条件，排除了肥料中一些物料如大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，同时，本发明方法选择性好，操作简单，成本低，普遍适用性高。
【专利说明】
-种水溶肥料中亮聚糖含量的检测方法
技术领域
[0001] 本发明设及水溶肥料检测技术领域，尤其设及一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测 方法。
【背景技术】
[0002] 壳聚糖(Chitosan，CTS)学名为β-1，4-2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，是甲壳质经浓碱 脱乙酷基后得到的衍生物。壳聚糖对植物病害有防治作用，其机理是诱导植物产生广谱抗 菌性，增强自身的防卫能力，抑制多种病源微生物的生长。近年来，壳聚糖类水溶肥料发展 迅速，已成为一种无毒、无公害、无污染、促进植物生长的新型肥料，并且广泛应用到农业生 产中。
[0003] 然而关于壳聚糖水溶肥料中壳聚糖的检测一直都没有适合的方法，在准确性上都 达不到要求，因此，国家或行业内没有一个统一的标准方法。运就导致无法验证产品指标的 真实性，也就无法控制产品质量，使得壳聚糖产品良莽不齐，不便于管理。因此基于运个缺 陷，在2013年9月农业部肥料登记评审委员会肥料评审组屯届二次会议上，对94个W海藻、 邮蟹壳、腐植酸锭、腐植酸钟、糖蜜、有机酸等为原料的获证有机水溶肥料进行了重新审核， 会议明确表示壳聚糖测定值作为登记评审的技术指标，暂不予W标注。运就表示生产壳聚 糖类水溶肥料的厂家不能再在产品上标识壳聚糖含量指标，该类产品也不能再W壳聚糖名 称来销售，只能W有机水溶肥料名称销售。运对生产企业和肥料行业都是一个很大的冲击， 壳聚糖类肥料产品的优势无法体现出来，运对厂家和消费者都是一个损失。因此，目前迫切 需要建立适合水溶肥料的壳聚糖含量检测方法。
[0004] 另一方面目前现有的关于肥料中壳聚糖含量检测方法，能查阅到的文献仅是韩书 霞、李德波等的《分光光度法测定肥料中壳聚糖含量》，文章中的方法存在缺陷：其一，未将 某些大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖检测的干扰考虑在内。而本
【申请人】则针对添加 各类原料对壳聚糖检测的干扰进行了大量组合试验，最终通过归纳总结大量实验数据可 知:①为肥料提供大量元素氮源的物质中所包含的Ν也+、Ν03^、尿素对测定有严重干扰，其中 畑4+、尿素使测定结果偏高5%-28%，而Ν03前存在则使测定无法正常进行，检测不到数值;② 为肥料提供微量元素的物质中所包含的Cu2\Fe2\B〇33^对测定有严重干扰，均使测定结果 偏低11%-48%;③有机物类原料生化黄腐酸、糖蜜发酵液均对测定存在严重干扰，使测定结 果偏高7%-130%。若不排除此类干扰，会严重影响测定数值的真实性;而提供大量元素憐源、 大量元素钟源、中量元素（巧和儀）、其他微量元素(锋和儘）W及其他一些有机物质（甘露 醇、薦糖、葡萄糖)则对壳聚糖检测基本无影响。
[0005] 其二，《分光光度法测定肥料中壳聚糖含量》文章中壳聚糖水解的酸类别及酸浓度 不是最佳条件。而本
【申请人】则采用不同种酸溶液及不同浓度酸溶液对壳聚糖进行水解，通 过大量实验室数据可W看出:硫酸溶液整体上水解效果都优于盐酸溶液。
[0006] 如何提供一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，确定最佳的水解条件W及排除 大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，真实客观反映水溶肥料中壳聚糖 含量，且方法符合普遍适用性，是壳聚糖类肥料行业内迫切需要的，运也是本发明面临的技 术问题。
【发明内容】
[0007] 本发明为解决现有存在的上述问题，提供了一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方 法，确定最佳的水解条件，排除水溶肥料中添加的各种物料(大量元素、微量元素及有机物） 对壳聚糖含量检测的干扰，真实客观反映水溶肥料中壳聚糖含量，且方法符合普遍适用性。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的：一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方 法，包括如下检测步骤： 1) 试样溶液的制备:准确称取固体或液体试样，固体试样配制成溶液备用，液体试样直 接备用;准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为I液;准确移取适量I 液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Π 液； 2) 工作曲线的绘制：W盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，与乙酷丙酬和对二甲氨基苯 甲醒进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，W标准系列盐酸氨基葡萄 糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线； 3) 试样的测定:若试样溶液Π 液为无色透明液体，则准确移取Π 液，与乙酷丙酬和对二 甲氨基苯甲醒进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据测得的吸光 值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量;若试样溶液Π 液为有色或不透明液 体，则准确移取Π 液，与乙酷丙酬和对二甲氨基苯甲醒进行显色反应生成红色化合物，在波 长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为Ai;另取1只比色管，加入与显色时相同体积的Π 液，加入无醒乙醇，将溶液用水稀释定容，摇匀，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记 为Ao;最终所得试样吸光值A=Ai-A〇。根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基 葡萄糖的质量； 4) 分析结果的表述 固体产品壳聚糖含量wW其质量分数(％)表示，按公式(1)计算：
液体产品壳聚糖含量P W其质量浓度(g/L)表示，按公式(2 )计算：
上述公式中，mi代表由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克(yg);m代 表固体试样的质量，单位为克(g);V代表液体试样的体积，单位为毫升(mL);V〇代表固体试 样溶解后的定容体积，单位为毫升(mL) ; Vi代表透析后定容的体积，单位为毫升(mL) ; V2代表 水解中和后定容的体积，单位为毫升(mL) ; VI代表移取I液水解的体积，单位为毫升(mL) ; V2 代表移取Π 液至比色管中的体积，单位为毫升(mL); 0.8309代表盐酸氨基葡萄糖折算为氨 基葡萄糖的系数。
[0009] 对上述技术方案的改进:所述步骤1)中，试样溶液水解前需进行透析，将干扰因素 NH4+、N03-、尿素、Cu2+、Fe2\B〇33-W及小分子有机物（分子量<500Da)排除，透析袋规格为 MWC0:100-500、透析时间为2地~72h。 对上述技术方案的进一步改进:所述步骤1)中，酸水解中所用酸溶液为硫酸溶液，水解 时溶液浓度为7-9mo 1 /L，水解溫度100°C~105°C，水解时间化~她。
[0010] 对上述技术方案的进一步改进:所述步骤1)中，I液酸水解后需要进行中和反应， 所用中和试剂为氨氧化钢溶液，浓度为200g/l~400g/L。
[0011] 对上述技术方案的进一步改进:所述步骤2)中，W盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶 液，标准溶液浓度为10~50yg/mL。
[0012] 本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果： 本发明方法从根本上确保了检测结果的真实可靠性，确定了壳聚糖的最佳水解条件， 排除了肥料中一些物料如大量元素、微量元素及有机物对壳聚糖含量检测的干扰，同时该 方法选择性好，操作简单，成本低，普遍适用性高，能完全满足现有壳聚糖类肥料市场上的 产品检测，使产品质量能得到有效控制，从而使壳聚糖类肥料产品能名正言顺的生产销售， 有效监督和制约生产企业，促使生产企业不断改革创新、提高生产技术，促进壳聚糖类肥料 行业的发展。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明的实施例1中氨基葡萄糖标准曲线； 图2为本发明的实施例2中氨基葡萄糖标准曲线； 图3为本发明的实施例3中氨基葡萄糖标准曲线。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1: 本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定固体产品，壳聚糖理论含量 33.7%，检测步骤如下： 1)试样溶液的制备 固体产品称取2.523?至lOOmL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，备用。
[001引移取l.OmL上述固体产品溶液至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至25mL 容量瓶中定容，称为I液，备用。
[0016] 准确移取I液3 . OmL至比色管中，加入2 . OmL浓硫酸，100°C水浴水解化。水解后用 400g/L氨氧化钢溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为Π 液，备用，Π 液为接近无 色透明液体。
[0017] 2)工作曲线的绘制 准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0血、1.0血、2. OmL、3.0血、4.0血、5.0血分别置于 比色管中，用水稀释至5.0mL，各加入乙酷丙酬溶液l.OmL，摇匀，沸水浴中（Imin后盖塞)放 置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醒溶液1 .OmL,再加入无醒乙醇 3. OmL,用力振摇后，于60 °C水浴中（15min后盖塞)放置化，取出立即用冷水冷却至室溫，在 波长525nm处，用1cm比色皿，W试剂空白为参比液，测其吸光值。
[0018] W标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲 线，如图1所示； 3)试样的测定 准确移取π液3. OmL置于比色管中，按步骤2)中"用水稀释至5. OmL"及w下步骤进行。
[0019] 根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
[0020] 4)分析结果的表述 固体产品壳聚糖含量wW其质量分数(％)表示，按公式(1)计算：
式中： mi-由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克(yg); m -固体试样的质量，单位为克(g); Vo -固体试样溶解后的定容体积，单位为毫升(mL)，100mL; Vi -透析后定容的体积，单位为毫升(mL)，25mL; V2 -水解中和后定容的体积，单位为毫升(mL)，50mL; VI -移取I液水解的体积，单位为毫升(mL); V2 -移取Π 液至比色管中的体积，单位为毫升(血）； 0.8309 -盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
[0021] 所测得壳聚糖含量如表1所示。
[0022] 表 1
所述步骤1)中透析袋的规格为MWC0:100-500，透析时间为24h。
[0023] 所述步骤2)中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为3化g/mL。
[0024] 所述步骤2)中乙酷丙酬溶液配制步骤为：取乙酷丙酬3.5mL，加入碳酸钢溶液至 50mL，置4 °C冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钢溶液浓度为1. Omo 1/L。
[0025] 所述步骤2)中对二甲氨基苯甲醒溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醒0.8g， 加无醒乙醇15. OmL及浓盐酸15. OmL，摇匀，现配现用。
[0026] 所述步骤4)中，分析结果的表述使用固体产品表述方式，W其质量分数(％)表示。
[0027] 实施例2: 本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定液体产品，壳聚糖理论含量 14.6g/L，检测步骤如下： 1)试样溶液的制备 准确移取1.OmL液体产品至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至化血容量瓶中 定容，称为I液，备用。
[0028] 准确移取I液2.5血至具塞试管中，加入2. OmL浓硫酸，100°C水浴水解化。水解后用 400g/L氨氧化钢溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为π液，备用，π液为接近无 色透明液体。
[00巧]2)工作曲线的绘制 准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0血、1.0血、2. OmL、3.0血、4.0血、5.0血分别置于 比色管中，用水稀释至5.0mL，各加入乙酷丙酬溶液l.OmL，摇匀，沸水浴中（Imin后盖塞)放 置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醒溶液1 .OmL,再加入无醒乙醇 3. OmL,用力振摇后，于60 °C水浴中（15min后盖塞)放置化，取出立即用冷水冷却至室溫，在 波长525nm处，用1cm比色皿，W试剂空白为参比液，测其吸光值。
[0030] W标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲 线，如图2所示； 3)试样的测定 准确移取Π 液3. OmL置于比色管中，按步骤2)中"用水稀释至5. OmL"及W下步骤进行。
[0031] 根据测得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
[0032] 4)分析结果的表述 液体产品壳聚糖含量P W其质量浓度(g/L)表示，按公式(2 )计算：
式中： mi-由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克(yg); V -液体试样的体积，单位为毫升(mL); Vi -透析后定容的体积，单位为毫升(mL)，25mL; V2 -水解中和后定容的体积，单位为毫升(mL)，50mL; VI -移取I液水解的体积，单位为毫升(mL); V2 -移取Π 液至比色管中的体积，单位为毫升(血）； 0.8309-盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
[0033] 所测得壳聚糖含量如表2所示。
[0034] 表 2
所述步骤1)中透析袋的规格为MWC0:100-500，透析时间为4她。
[0035] 所述步骤2)中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为3化g/mL。
[0036] 所述步骤2)中乙酷丙酬溶液配制步骤为：取乙酷丙酬3.5mL，加入碳酸钢溶液至 50mL，置4 °C冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钢溶液浓度为1. Omo 1/L。
[0037] 所述步骤2)中对二甲氨基苯甲醒溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醒0.8g， 加无醒乙醇15. OmL及浓盐酸15. OmL，摇匀，现配现用。
[0038] 所述步骤4)中，分析结果的表述使用液体产品表述方式，W其质量浓度(g/L)表 /J、- 〇
[0039] 实施例3: 本发明一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，测定液体产品，壳聚糖理论含量 20.5g/L，检测步骤如下： 1)试样溶液的制备 准确移取1.OmL液体产品至透析袋中进行透析。透析结束后，试样转移至化血容量瓶中 定容，称为I液，备用。
[0040] 准确移取I液2.5血至具塞试管中，加入2.OmL浓硫酸，100°C水浴水解化。水解后用 400g/L氨氧化钢溶液调至中性，然后定容至50mL容量瓶中，称为Π 液，备用，Π 液为褐色溶 液。
[0041] 2)工作曲线的绘制 准确移取盐酸氨基葡萄糖标准溶液0.0血、1.0血、2. OmL、3.0血、4.0血、5.0血分别置于 比色管中，用水稀释至5.OmL,各加入乙酷丙酬溶液1.OmL,摇匀，沸水浴中（Imin后盖塞)放 置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醒溶液1 .OmL,再加入无醒乙醇 3. OmL,用力振摇后，于60 °C水浴中（15min后盖塞)放置化，取出立即用冷水冷却至室溫，在 波长525nm处，用1cm比色皿，W试剂空白为参比液，测其吸光值。
[0042] W标准系列盐酸氨基葡萄糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲 线，如图2所示； 3)试样的测定 准确移取Π 液3. OmL置于比色管中，用水稀释至5. OmL，加入乙酷丙酬溶液1.0血，摇匀， 沸水浴中（Imin后盖塞)放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，加入对二甲氨基苯甲醒溶液 1 .OmL,再加入无醒乙醇3. OmL,用力振摇后，于60 °C水浴中（15min后盖塞)放置比，取出立即 用冷水冷却至室溫，在波长525皿处，用1cm比色皿，W试剂空白为参比液，测其吸光值，吸光 值读数记为Ai;另取1只比色管，准确移取Π 液3.OmL置于比色管中，用水稀释至7. OmL,摇 匀，沸水浴中（Imin后盖塞)放置25min，取出，用冷水迅速冷却后，再加入无醒乙醇3.OmL,用 力振摇后，于60 °C水浴中（15min后盖塞)放置化，取出立即用冷水冷却至室溫，在波长525皿 处，用1cm比色皿，W试剂空白为参比液，测其吸光值，吸光值读数记为Ao;最终试样溶液吸 光值A=Ai-A〇。根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量； 根据所得的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量。
[0043] 4)分析结果的表述 液体产品壳聚糖含量P W其质量浓度(g/L)表示，按公式(2 )计算： 巧甲：
mi-由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克(yg); V -液体试样的体积，单位为毫升(mL); Vi -透析后定容的体积，单位为毫升(mL)，25mL; V2 -水解中和后定容的体积，单位为毫升(mL)，50mL; VI -移取I液水解的体积，单位为毫升(mL); V2 -移取Π 液至比色管中的体积，单位为毫升(血）； 0.8309-盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。
[0044] 所测得壳聚糖含量如表3所示。
[0045] 表 3
所述步骤1)中透析袋的规格为MWC0:100-500，透析时间为4她。
[0046] 所述步骤2)中盐酸氨基葡萄糖标准溶液浓度为3化g/mL。
[0047] 所述步骤2)中乙酷丙酬溶液配制步骤为：取乙酷丙酬3.5mL，加入碳酸钢溶液至 50mL，置4 °C冰箱中备用，应于使用前一日配制。碳酸钢溶液浓度为1. Omo 1/L。
[004引所述步骤2)中对二甲氨基苯甲醒溶液配制步骤为：称取对二甲氨基苯甲醒0.8g， 加无醒乙醇15. OmL及浓盐酸15. OmL，摇匀，现配现用。
[0049] 所述步骤4)中，分析结果的表述使用液体产品表述方式，W其质量浓度(g/L)表 /J、- 〇
[0050] W上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是 W上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做 的任何修改、补充或等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤： 1) 试样溶液的制备:准确称取固体或液体试样，固体试样配制成溶液备用，液体试样直 接备用;准确移取适量该溶液至透析袋中进行透析，透析结束后定容为I液;准确移取适量I 液至具塞试管中，加酸水解，水解后中和，定容为Π 液； 2) 工作曲线的绘制：以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯 甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，以标准系列盐酸氨基葡萄 糖质量为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制工作曲线； 3) 试样的测定:若试样溶液Π 液为无色透明液体，则准确移取Π 液，与乙酰丙酮和对二 甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波长525nm下测定吸光值，根据测得的吸光 值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基葡萄糖的质量;若试样溶液Π 液为有色或不透明液 体，则准确移取Π 液，与乙酰丙酮和对二甲氨基苯甲醛进行显色反应生成红色化合物，在波 长525nm下测定吸光值，吸光值读数记为A1;另取1只比色管，加入与显色时相同体积的Π 液，加入无醛乙醇，将溶液用水稀释定容，摇匀，在波长525nm下测定吸光值，吸光值读数记 为A〇;最终所得试样吸光值AiAi-Ao;根据得到的吸光值，在工作曲线上查得对应的盐酸氨基 葡萄糖的质量； 4 )分析结果的表述 固体产品壳聚糖含量w以其质量分数百分比表示，按公式(1)计算：液体产品壳聚糖含量P以其质量浓度表示，单位为g/L，按公式(2)计算：上述公式中，πη代表由工作曲线查得的盐酸氨基葡萄糖的质量，单位为微克;m代表固体 试样的质量，单位为克;V代表液体试样的体积，单位为毫升;VQ代表固体试样溶解后的定容 体积，单位为毫升;Vi代表透析后定容的体积，单位为毫升;％代表水解中和后定容的体积， 单位为毫升;^代表移取I液水解的体积，单位为毫升;v 2代表移取Π 液至比色管中的体积， 单位为毫升;〇. 8309代表盐酸氨基葡萄糖折算为氨基葡萄糖的系数。2. 按照权利要求1所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1) 中，试样溶液水解前需进行透析，将干扰因素 NH4+、N03'尿素、Cu2+、Fe2+、B03 3-以及小分子有 机物排除，透析袋规格为MWC0:100-500、透析时间为24h~72h。3. 按照权利要求1所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1) 中，酸水解所用酸溶液为硫酸溶液，水解时硫酸溶液浓度为7_9mol/L，水解温度为100°0 105°C，水解时间为6h~8h。4. 按照权利要求1所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所述步骤1) 中，I液酸水解后需要进行中和反应，所用中和试剂为氢氧化钠溶液，浓度为200g/L~400g/ L〇5. 按照权利要求1-4任一项所述的水溶肥料中壳聚糖含量的检测方法，其特征在于，所 述步骤2)中，以盐酸氨基葡萄糖溶液为标准溶液，标准溶液浓度为10~SOyg/mL。
【文档编号】G01N1/28GK105823746SQ201610342059
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】单俊伟, 王海华, 郝晓晨, 王鹏
【申请人】青岛海大生物集团有限公司