一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强l-色氨酸产量的基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程菌及 其构建方法，特别是利用蛋白质工程的定点突变方法来降低比活力的技术及利用Red重组 技术，通过两步无痕替换法在基因组上进行基因置换的技术，属于代谢工程和基因工程领 域。
【背景技术】
[0002] L-色氨酸（L-tryptophan, L-Trp)作为人体内的一种必需氨基酸，广泛应用于医 药、食品、饲料等行业。近年来，国外通过代谢工程的手段，逐渐培育出一批高产的L-Trp生 产菌株，但其在发酵过程中仍存在发酵后期L-Trp生产速率下降明显，副产物积累等问题， 尤其是副产物乙酸的积累。当乙酸浓度超过2g/L时就会影响菌株的生长及L-Trp的合成， 为尽可能的减少发酵过程中乙酸的积累以保证菌体的正常生长，发酵过程中必须保证溶氧 充足，然而这在工业化生产中不仅增加成本而且也很难达到实验室提供的溶氧条件。因此 减少发酵过程中乙酸的积累及降低菌体对溶氧的需求，对提高L-Trp的工业化生产具有重 要意义。
[0003] 大肠杆菌通过两条途径生成乙酸：⑴丙酮酸氧化酶途径，丙酮酸在PoxB作用下生 成乙酸；⑵乙酰磷酸途径，acetyl-CoA在Pta (磷酸乙酰基转移酶）作用下生成acetyl-p, 然后AckA(乙酸激酶）催化acetyl-p生成乙酸，而后者是生成乙酸的主要途径。磷酸乙酰 基转移酶是微生物体内乙酸代谢途径AckA-pta中的一个关键酶，也是在工业微生物发酵 过程中产生副产物乙酸的关键酶之一。因此获得比活力降低的磷酸乙酰基转移酶突变体， 并对基因组上的原编码基因进行替换，编码比活力降低的磷酸乙酰基转移酶，有助于减少 发酵过程中乙酸的积累，从而有利于实现菌株的高密度发酵，而且有利于增加L-色氨酸的 生成。本发明以L-色氨酸生产菌株（重组大肠杆菌）FB-04(记作TS)(J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38:1921 - 1929)为出发菌株，在其基因组上将磷酸乙酰基转移酶编码基 因内的一个碱基进行替换，导致其编码的第69位脯氨酸替换成亮氨酸，降低了磷酸乙酰基 转移酶的比活力，发酵过程中副产物乙酸的积累减少，L-色氨酸产量增加，为工业化发酵生 产其他氨基酸提供借鉴。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程 菌，其特征在于，在L-色氨酸生产菌株（重组大肠杆菌）FB-04(记作TS) (J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38:1921 - 1929)基因组上将磷酸乙酰基转移酶编码基因内的一个碱基 进行替换，导致其编码的第69位脯氨酸替换成亮氨酸，降低了磷酸乙酰基转移酶的比活 力，发酵过程中副产物乙酸的积累减少，L-色氨酸产量增加。
[0005] 所述磷酸乙酰基转移酶突变体以大肠杆菌TS磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列（与 NCBI登录号：NP_416800. 1所示氨基酸序列相同）为出发序列，将第69位脯氨酸替换成亮 氨酸得到的突变体。
[0006] 能表达权利要求1所述磷酸乙酰基转移酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系， 及在基因组上进行无痕替换的载体也属于本专利要求保护的范围。
[0007] 本发明不仅提供一种制备所述磷酸乙酰基转移酶突变体的方法，还提供一种制备 所述突变菌株的方法。利用Red重组方法，通过两步无痕法在基因组上进行基因置换。
[0008] 具体而言，是以大肠杆菌TS磷酸乙酰基转移酶核苷酸序列为出发序列，将其内部 一个碱基进行替换，使第69位脯氨酸替换成亮氨酸，并在TS基因组上进行磷酸乙酰基转移 酶编码基因的置换，使其编码的氨基酸第69位脯氨酸替换成亮氨酸得到的突变菌株。
[0009] 所述制备一种弱化发酵过程中乙酸积累以增强L-色氨酸产量的基因工程菌的方 法，具体步骤如下：
[0010] 1)利用Swiss-model软件对源自大肠杆菌磷酸乙酰基转移酶进行模拟，获得磷酸 乙酰基转移酶空间结构，通过对磷酸乙酰基转移酶的序列以及空间结构进行分析，确定要 突变的氨基酸位点。
[0011] 2)根据大肠杆菌磷酸乙酰基转移酶氨基酸序列（NCBI登录号：NP_416800. 1)，将 其所对应的编码核苷酸序列（Genbank登陆号NC_000913. 3 :2414747-2416891)克隆到质粒 pET-24a(+)中，构建重组质粒。
[0012] 3)设计突变引物，对磷酸乙酰基转移酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨 基酸进行替换，获得含有突变磷酸乙酰基转移酶序列的重组载体。
[0013] 4)设计重叠PCR引物，分别以pKD13质粒和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168)基因组为模版，通过重叠PCR的方法得到卡那霉素和SacB基 因相连的DNA片段，将此片段克隆到pMD18载体中，构建用于无痕替换的质粒kan-sacB/ pMD18。
[0014] 5)设计含磷酸乙酰基转移酶基因同源臂的重组引物，以kan-sacB/pMD18质粒为 模版，采用PCR方法得到两端含同源臂的kan-sacB DNA片段，将此片段转入到TS菌中，利 用Red重组获得基因组上磷酸乙酰基转移酶基因被kan-sacB DNA片段替换的突变菌株。
[0015] 6)以3)所述突变的重组载体为模板，将用PCR方法得到的突变的磷酸乙酰基转移 酶基因转入到5)所述的菌株中，利用Red重组获得基因组上磷酸乙酰基转移酶突变的突变 菌株。
[0016] 本发明提供的磷酸乙酰基转移酶突变体比活力显著降低，为突变前的60. 4%。相 对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了改造时间。将色氨酸生产菌株TS的基因组上的磷酸乙 酰基转移酶编码基因替换成带有相应突变的突变体，得到L-色氨酸突变菌株TS-PtaP69L。 将该磷酸乙酰基转移酶突变体应用于工业微生物发酵领域，有利于在微生物高密度发酵过 程中减少乙酸的积累，增加发酵目的产物的产生，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图 lkan-sacB/pMD18 质粒图谱
[0018] 图2突变菌株（TS_PtaP69L)与对照（TS)摇瓶发酵乙酸含量
[0019] 图3突变菌株（TS-PtaP69L)与对照（TS)摇瓶发酵色氨酸含量
[0020] 图4突变菌株（TS-PtaP69L)与对照（TS) 3L发酵罐发酵乙酸含量
[0021] 图5突变菌株（TS-PtaP69L)与对照（TS) 3L发酵罐发酵色氨酸含量
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 :野生型磷酸乙酰基转移酶基因的克隆及重组菌株的构建
[0023] 以磷酸乙酰基转移酶编码基因序列（Genbank登陆号NC_000913. 3: 2414747-2416891)为模板，设计扩增引物P1和P2,采用PCR方法扩增磷酸乙酰基转移酶 基因pta，克隆到pMD18载体（商业化工具载体），连接产物转化大肠杆菌JM109,转化产物 涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37°C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基， 8-10h后提取质粒，命名为pta/pMD18,将此质粒进行序列测定。结果表明插入片段为一个 2145bp的DNA片段，编码一个含有704个氨基酸的蛋白质。将pET24a(+)质粒和含有pta 基因的T载体分别进行Nde I和Hind III双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接。 连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，经37°C培养8h，挑转化子在含有30mg/L卡纳霉 素的LB中振荡培养，提取质粒，酶切验证，得到表达质粒pta/pET24a(+)。
[0024] 将质粒pta/pET24a(+)转化E. coli BL21(DE3)宿主菌，涂布含卡纳霉素（30mg/ L)的LB平板上，37°C培养8h，命名为pta/pET24a(+)/BL21 (DE3)。挑单菌落至液体LB中， 37 °C培养过夜，保存甘油管。
[0025] 磷酸乙酰基转移酶编码基因扩增引物：
[0026]正向引物 P1:5 '-AAACATATGTCCCGTATTATTATGCTGATCC-3'
[0027]反向引物 P2:5 ' -CCCAAGCTTTTACTGCTGCTGTGCAGACTG-3 '
[0028] 实施例2 :突变体的制备
[0029]1)突变体的构建
[0030] 对来源于L-色氨酸生产菌株（重组大肠杆菌）FB-04 (记作TS) (J Ind Microbiol Biote