一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重pcr试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明设及一种芽抱杆菌的检测技术，特别是快速检测凝结芽抱杆菌的方法及多 重PCR试剂盒。
【背景技术】
[0002]凝结芽抱杆菌度acillus coagulans)为革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，芽抱端生，可 发酵糖类产生k乳酸，所W又被称为"有抱子性乳酸菌"。由于菌株自身的安全性、有效性、 经济性和环境友好性，成为我国农业部《饲料添加剂品种目录》(2008)批准使用的新型微生 物饲料添加剂。凝结芽抱杆菌不仅具有普通乳酸菌的益生保健功能，还具较强的耐胃酸、耐 高溫高压、易培养和储存等优势，是益生菌领域中的后起之秀，被广泛应用于医疗、保健、食 品、畜禽及水产养殖等领域。
[0003]目前，市场上凝结芽抱杆菌产品制剂较多，但缺乏规范的管理及科学的评估手段 和参数标准，使得一部分微生态制剂生产厂家提供的产品质量、价格参差不齐。市面上一些 厂家利用甲基营养型芽抱杆菌、解淀粉芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌或地衣芽抱杆菌冒充凝结 芽抱杆菌高价售卖，牟取暴利，严重影响了用户对该类产品的选择。因而，建立一种快速、高 效、准确的鉴定方法显得非常重要。
[0004]近年来分子生物学技术的快速发展，已有应用PCR技术和环介导等溫扩增技术， 检测凝结芽抱杆菌的方法。CN102533743B"-种用于扩增凝结芽抱杆菌的特异性引物及其 应用"，公开了通过特异性的扩增comK基因来检测凝结芽抱杆菌的方法，用该方法扩增凝结 芽抱可获得400bp的特异性片段，扩增炭痘芽抱杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽抱杆菌、红球 菌时，则无特异性片段。该检测方法仅扩增凝结芽抱杆菌的一段基因序列，易出现假阳性。
[0005] CN104152543A " -种凝结芽抱杆菌检测引物组、试剂盒及其方法"，用该方法能从 凝结芽抱杆菌DNA中扩增出大量的梯度大小核酸片段，而未能从其他属细菌DNA中扩增出 核酸片段。所述其他属细菌为枯草芽胞杆菌、蜡状芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌 和大肠杆菌标准株。
[0006]然而与凝结芽抱杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱 杆菌，在上述方法中均没有进行检测，难W保证检测方法的准确性。此外，巧光定量PCR和 环介导等溫扩增技术，存在仪器昂贵、人员要求较高或难定量、非特异性高等缺陷。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种快速检测凝结芽抱杆菌的方法及多重PCR试剂盒，该方法检测快 速准确，敏感性高，且操作简单成本低。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种快速检测凝结芽抱杆菌的方法，包括 W下步骤：
[0009] (1)提取样品DNA ;
[0010] (2)PCR扩增；所述PCR扩增W样品DNA为模板，用PCR扩增引物进行扩增；所述 PCR扩增引物包含两对PCR扩增引物，分别为引物对1和引物对2 ;所述引物对1为coag-F和coag-R，引物对2为comK-F和comK-R;所述引物序列如沈QIDNO:1~4所示；
[0011] 做结果检测。
[001引进一步的是，所述步骤（2)PCR扩增包括PCR总体系的配置和PCR扩增反应。
[001引进一步的是，所述PCR总体系容积为25μL包括PCR扩增引物、PCR反应试剂 (10XPCRMix)、DNA模板W及双蒸水（dd&0)。
[0014] 进一步的是，所述PCR总体系中各组分含量为：
[0015] 10XPCR Mix 12. 5 nL (id Ι?：0 9. 1 μ L· DNA模板 1.0 μ L· coag-F 0. 2 μ L·
[0016] 城过曼-R 0. 2 μ L comK-F 1.0 μ1., comK'-R 1.0 μ1.,
[0017] 进一步的是，所述PCR扩增反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s，54°C退 火30s，72°C延伸Imin，扩增30个循环，最后72°C溫育5min。
[0018] 进一步的是，所述结果检测的方法为琼脂糖凝胶电泳。
[0019] 一种快速检测凝结芽抱杆菌的多重PCR试剂盒，包含两对PCR扩增引物，分别为引 物对1和引物对2 ;所述引物对1为coag-F和coag-R，引物对2为comK-F和comK-R;所述 引物序列如SEQIDNO:1~4所示。
[0020] 进一步的是，所述试剂盒包含PCR反应试剂，阳性及阴性对照样品。
[0021] 本发明具有W下有益效果：提供的试剂盒和方法可W特异的扩增凝结芽抱杆菌基 因组中的coag基因和comK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。特 别是与凝结芽抱杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌，不能 扩增得到基因片段。因此能够准确、有效的检测出待检样品中是否存在凝结芽抱杆菌。并 且敏感性高、检测快捷方便，可用于凝结芽抱杆菌样品的快速检测，帮助筛选性价比较优良 的凝结芽抱杆菌产品，降低用户经济损失。
【附图说明】
[002引 图1为单一引物PCR扩增电泳图；
[002引 图2为双重PCR条件优化；
[0024] 图3为引物特异性检测电泳图；
[0025] 图4为引物灵敏度检测电泳图。
【具体实施方式】
[0026] 结合W下具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。
[0027] 实施例1
[002引 PCR扩增引物的设计和效果
[002引一、实验方法
[0030] 1、PCR扩增引物设计与合成
[0031] 根据GeneBank中凝结芽抱杆菌基因组的coaG基因序列和comK基因序列，用 Primer Premier 5.0软件设计两对引物，见表1。引物对1为coag-F和coag-R，分别扩 增coaG基因的正向和反向序列，为SEQIDN0:1和SEQIDN0:2所示的序列；引物对2为 comK-F和comK-R，分别扩增comK基因的正向和反向序列，为沈QIDN0:3和沈QIDN0:4 所示的序列。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[003引表1PCR扩增引物资料
[0033]
[0034] 2、模板的制备
[0035] 按照无菌操作要求，将凝结芽抱杆菌标准菌株（CICC20138)接种于凝结芽抱杆 菌培养静置培养36h，取2mL菌液提取DNA。液体培养基，37°C恒溫细菌基因组DNA提取操 作步骤如下：
[0036] (1)取过夜培养的细菌菌液4mL，10 00化/min离屯、Imin，尽量吸尽上清液。
[0037] 似向菌体沉淀中加入200μL缓冲液（称取20mg的溶菌酶溶解在1血TE缓冲液 中，制成终浓度为20mg/血的溶菌酶液，0. 22μm微孔过滤后保存备用），37°C处理40min。[003引（3)向管中加入20μLProteinaseK溶液，混匀。
[003引 （4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70°C放置lOmin，溶液变清亮，简短离心去 除管盖内壁水珠。
[0040] (5)加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
[0041] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12 00化/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0042] (7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇），12 00化/ min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[004引 做向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇），12OOOr/ min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0044] (9)重复操作步骤做。
[0045] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 0(K)r/min离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱 CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残留的漂洗液。
[0046] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100μL无菌双蒸水，室溫放置5min，12 0(K)r/min离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中。
[0047] 3、单一引物的PCR扩增
[0048] 取步骤2提取的凝结芽抱杆菌标准菌株基因组DNA作为模板，分别取步骤1中的 两对引物按照W下程序分别扩增：
[004引 （1)扩增coag基因
[0050]PCR总体系为25μL各组分含量分别为：
[0051] 10XPCR Mix 12.5 μL (id Π,Ο 8.5 uL DNA模板 2. 0 μ ?., coag-F (10 ppm) 1.0 μL- coag-R (10 ppm) 1.0 μ ?-
[0052]反应程序：94°(：预变性1〇111111，94°(：变性3〇3,60°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，扩增 30个循环，最后72°C溫育5min。
[00閲 似扩增comK基因
[0054] PCR总体系为25μL各组分含量分别为：
[00巧] 10XPCR Mix 12.5 μL dd Π,Ο 8.日μ L DNA模板 2. 0 μ L coffiK-F (10邮m) 1. 0 μ L cornK-R (10 ρρπι) 1.0 μ ?.
[0056] 反应程序：94°C预变性10min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸Imin，扩增 30个循环，最后72°C溫育5min。
[0057] 4、双重PCR扩增
[0058]W步骤2提取的凝结芽抱杆菌标准菌株（CICC20138)基因组DNA作为模板，取步 骤1中的两对引物进行双重PCR扩增。
[0059]PCR总体系为25μL各组分含量分别为：
[0060] 1 ο X PGR Mix 12. 5 μ L· dd化0 e.1bL 隨描模板 1. :0 b l cong-F 0 之iI :色0进甚-R Q. 2 ii L :色o抽K-i 1. 0供L eofflK-K 1..:0供L
[0061]反应程序：94°(：预变性1〇111111，94°(：变性3〇3,54°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，扩增30个循环，最后72°C溫育5min。
[00的]5.结果检测
[0063] 取5μΙPCR扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳 45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
[0064]二、结果
[006引 1、单一引物PCR扩增结果
[0066] 如图1所示，1号泳道为使用引物对1进行扩增的结果，出现大小约为33化P的扩 增片段；2号泳道为使用引物对2进行扩增的结果，出现大小约为75化P的扩增片段。
[0067] 两个基因扩增的目的片段测序结果在NCBI数据库中进行BLASTn比对分析，比对 结果显示，测序结果与数据库中凝结芽抱杆菌coag基因和comK基因序列的相似性高达 98%~99%。
[006引 2、双重PCR扩增结果
[0069] 如图2所示，3号泳道为使用两对引物进行扩增的结果，出现两条清晰条带，大小 分别约为345bp与769bp。
[0070] 本实例表明了本发明所设计的引物可W分别扩增出目的基因序列，即扩增出凝结 芽抱杆菌基因组中的coag基因与comK基因。并且用本发明所设计的两对引物进行双重 PCR，可W特异的扩增出凝结芽抱杆菌基因组coag基因与comK基因，无其他任何杂带。说 明两对引