一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术 领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，我国水产养殖业蓬勃发展，极大地丰富了人们的物质生活。但随着高密度 集约化养殖规模日益扩大，养殖水体生态环境日益恶化，极大地增加了水产动物之间病原 体交叉感染的机会，造成各类鱼病多发，甚至水产动物大面积的死亡。针对鱼病的防治，传 统的方法是使用抗生素，短期可能起到较好的效果，但长期使用容易导致病原菌的耐药性 越来越强，水生动物肠道内菌群失衡，长期富集在体内通过食物链影响人类健康等弊端。用 微生态制剂进行水产养殖动物病害的防治是近年发展起来的一种新方法，能够有效避免服 用抗生素所造成的耐药性和二次感染等，其凭借独特的调节肠道菌群的功能而备受世人瞩 目。
[0003] 乳酸菌类益生菌是目前我国农业部、美国食品及药物管理局（FDA)等国内外政府 批准使用的数量最多、效果较好的一类安全微生物菌种。它具有以下特点：耐酸，在pH为 3. 0 - 4. 5时仍可生长，适应于胃肠的酸性环境；乳酸菌是动物肠道的正常菌群，在肠系统 定植，在体内通过生物拮抗，拮抗革兰氏阴性致病菌，维持肠道中正常的生态平衡；可降低 肠道pH值，阻止和抑制有害物质，增强抗感染能力；活菌体内的代谢产物中含有较高的超 氧化物歧化酶（S0D)，能增加动物的体液免疫和细胞免疫，增强机体的免疫调节活性，促进 生长。但普通乳酸菌在生长过程中，不形成芽孢，抗逆性差，易失活，难保藏，所以在饲料工 业中的应用受到一定限制。本发明所应用的凝结芽孢杆菌正好弥补这一缺憾。凝结芽孢杆 菌，是一类能够产芽孢的乳酸菌，除了具有乳酸菌的特点外，还具有 抗逆性强、耐高温、易保存、存活率高等优点。
[0004] 本发明涉及凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1对多种水产常见病菌的广谱拮抗作用， 同时该菌株还兼具养殖环境控制功能和促进水生动物的生长的特点，是一种新型的多功能 微生物。目前尚无凝结芽孢杆菌此方面的专利报道。
[0005] 在水广养殖中应用该囷株制备的微生态制剂能够1?效调控水质、防治疾病、促进 水生动物生长，满足水产养殖对疾病防控、水体生态环境治理和健康养殖的高度需求。在淡 水生态健康养殖推广应用中，与传统的以药物使用为主的水质调控和病害防治技术相比， 微生态制剂具有主动预防，无毒、无残留，无污染的优点，对形成良好的养殖生态环境，减少 养殖污水的排放，消除水产品中药物的残留，保护环境具有重要意义。同时作为水产饲料添 加剂能够有效促进水产养殖动物健康生长，带动水产养殖经济效益的提高，促进水产养殖 户增产增收。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种对水产养殖常见病原菌具有拮抗作用、能够净化养殖水 体、促进水生动物生长的凝结芽孢杆菌菌株。
[0007] 为达到以上目的，本发明的技术方案是：提供一株具有水产病原菌拮抗特性的 凝结芽孢杆菌菌株，分离自鱼类肠道，该菌株的分类命名为：凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号：CGMCC No. 10182。本发明的凝结芽孢杆菌菌株JSSW-LA-07-1，革兰氏阳性菌，镜检 呈杆状，细胞直径< 1 μ m，芽孢膨大。在MRS平板上菌落直径为2. 0-3. Omm，形态不规则，表 面褶皱、不透明、无色素。在LB培养基上可得大量圆形、表面褶皱、不透明、白色的菌落。
[0008] 本发明的制备工序如下： (1)菌种活化： 无菌开启凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1的冻干保藏菌种，划线接种于麸皮营养琼脂试 管斜面，于30-37 °C培养24-48 h，然后划线转接于麸皮营养琼脂茄子瓶斜面，30-37 °C培 养24-48 h。镜检，当90 %以上菌体形成芽孢时，即为成熟。反复活化2-3次，种子菌悬液以 体积比1%-1〇%接种量接入装有发酵培养基的三角瓶中，三角瓶装液量为体积比10%-20%， 转速为100-180 rpm，30-37°C恒温振荡培养20-24h ; 斜面培养基组成以g/L计：蛋白胨10,牛肉膏3, NaCl 5,琼脂15-20,蒸馏水1L，pH 7. 0-7. 2。
[0009] 发酵培养基组成以g/L计：麸皮5-20,酵母膏5-10,豆柏粉5-10, Κ2ΗΡ04 3, NaCl 5, MnS04 · H20 0· 3，蒸馏水 1L，pH 7· 0。
[0010] (2)抑菌性测定： 将无菌滤纸片在浓度约为?ο7 CFU/mL凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1新鲜培养液中浸泡 1.0 h。取浓度约5X106 CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维 氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、溶藻弧 菌的液体培养液〇. 1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤纸片贴 于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于25-30°C培养箱中24、48 h， 测量抑菌圈大小。
[0011] (3)凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备及应用： 菌种JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液高速离心收集湿菌体，湿菌体与 干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50°C下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0. 9mm筛，获 得的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，浓度不低于5. OX 10s个（CFU) /克。
[0012] 用所述方法制备的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的应用，用作渔业养殖 饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1. 0-5. Omg *kg 1的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1 菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩?米的用量全池泼洒凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1 菌粉制剂。
[0013] 本发明的有益效果： 凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1能够有效抑制嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单 胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌的生长，其中对温和气单胞 菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果优于其他种类致病菌。因此，在水产养殖中使用凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够有效防控由病原菌引发的水产养殖动物病害，保护水生动物健 康生长。
[0014] 凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂作为渔业养殖饲料添加剂能够显著提高水 生动物的增重率、特定增长率，显著降低饵料系数。
[0015] 凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂作为水产养殖用水质改良剂能够有效降低 水体中的污染物含量，改善养殖水质。
[0016] 生物材料样品保藏：凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1,已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2014年12月15日，保藏号为：CGMCC No.10182。
【附图说明】
[0017] 图1 JSSW-LA-07-1的系统发育树。
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 :菌种的筛选和分离 在无锡鹅湖养殖池塘采集异育银鲫样品，将鱼体解剖取肠道，加入生理盐水，研磨制成 匀浆液，每个样品吸取1.0 mL，80°C加热10 min，取移液枪吸取0. 1 mL于YPD固体培养基 上，涂布，37°C培养。根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单 个菌落，命名为JSSW-LA-07-1。
[0019] 实施例2:菌种鉴定 (1)形态特征 菌株JSSW-LA-07-1，革兰氏染色为阳性，镜检呈杆状，细胞直径< ΙμL?，能形成芽孢。 在MRS平板上菌落直径为2. 0-3. 0mm，形态不规则，表面褶皱、不透明、无色素。在LB培养基 上可得大量圆形、表面褶皱、不透明、白色的菌落。
[0020] (2)生化特性 菌株JSSW-LA-07-1，革兰氏染色为阳性，接触酶、β -半乳糖苷酶、VP试验、甲基红试验 为阳性，能在50°C环境下生长。氧化酶、脲酶、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧 酶试验为阴性，不能水解淀粉、明胶、酪素，不产生吲哚和H 2S，不能在柠檬酸上生长。
[0021] 生长实验结果显示该菌株能利用D-纤维二塘、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、 D-海藻糖、糊精、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-葡萄胺、甘油，产L-乳酸、丙酮酸甲酯。反硝化试 验为阳性，说明该菌株能够降解水体中的含氮化合物。
[0022] 化学敏感实验结果显示，该菌株对林可霉素、二甲胺四环素、夫西地酸、盐酸胍、 氯化锂、十四烷硫酸钠、D-丝氨酸、万古霉素、醋竹桃霉素、利福霉素 SV、丁酸钠、溴酸钠、