一种产中性蛋白酶的凝结芽孢杆菌Liu-g1活菌制剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备方法，适 用于畜禽养殖业功能性微生态制剂的生产。
【背景技术】
[0002] 饲用微生态制剂是采用农业部认可的动物肠道有益微生物经发酵、纯化、干燥而 精制的复合生物制剂，是一种减少或替代抗生素使用的绿色生物添加剂。
[0003] 1989年，美国食品与药物管理局（抑A)和美国饲料控制官员协会公布了可W直 接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单共42种，其中包括凝结芽抱杆菌度acillus coagulans)。我国农业部《饲料添加剂品种目录（2013)》发布的饲料添加剂包括凝结芽抱 杆菌，可饲喂肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物。凝结芽抱杆菌为兼性厌氧菌，在有氧条件 下有利于繁殖菌体，在无氧条件下产生大量乳酸。该菌既具有乳酸菌产乳酸的特性，又具有 良好的抗逆性。其芽抱对高溫及低抑环境具有很强的耐受性，可顺利通过胃肠道逆环境， 并发挥良好的益生效果，因此可用于制备微生态制剂。
[0004] 凝结芽抱杆菌可发酵葡萄糖、薦糖、麦芽糖、甘露醇、棉子糖、海藻糖产酸而不产 气。该菌具有丰富的能够水解大分子物质的胞外酶系，可产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纤 维素酶等活性物质，有助于增强胃肠道对食物的消化与吸收能力，提高饲料转化率，因此可 作为饲用微生态制剂而广泛应用于畜禽饲养中。此外，凝结芽抱杆菌还可产生P-半乳糖 巧酶与乳酸脱氨酶，因此有助于乳糖不耐受症人群对乳糖的消化。
[0005] 本发明设及的产中性蛋白酶凝结芽抱杆菌Liu-gl可用于发酵生产活菌制剂。 经过本发明优化培养基配方与发酵条件后，活菌制剂中Liu-gl菌株的活菌数量可达到 l〇iiC即/gW上。将凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂添加到畜禽饲料中，可提高畜禽对饲料 中蛋白质的消化吸收。此外，试验研究表明，该菌还能分泌a-淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等 酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类共同发挥作用，提高饲料利用率。
[0006] 在制备凝结芽抱杆菌活菌制剂过程中，由于发酵培养基配方直接影响凝结芽抱杆 菌的活菌数量、发酵时间和生产成本，故优化发酵培养基的配方是本发明的关键技术。
[0007]目前，国内申请凝结芽抱杆菌的专利较多，
【发明内容】
大多是凝结芽抱杆菌的菌种 检测技术和芽抱的制备方法，如发明专利CN1103160455A公开了 "凝结芽抱杆菌的芽抱制 剂的制备方法"，该专利报道采用半封闭式固体发酵工艺，生长后期氧气大量减少，刺激芽 抱快速形成；如发明专利CQ102304559A公开了 "凝结芽抱杆菌的巧光定量PCR快速检测 方法"，该专利报道了一种快速检测凝结芽抱杆菌的巧光定量PCR方法。
[0008] 关于凝结芽抱杆菌发酵方面的专利：如发明专利CN103289910A公开了 "一种凝 结芽抱杆菌的固体发酵生产方法"，该专利报道了凝结芽抱杆菌的固体发酵生产方法，采用 凝结芽抱杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，溫度为37~4(TC的条件下培养，经 过S级种子扩大培养而进行大规模发酵生产；如发明专利CN103911326A公开了 "凝结芽 抱杆菌益生菌制剂的制备"，该专利报道了一种凝结芽抱杆菌利用分段接种技术，混菌发酵 对菌种的生长、增殖具有互相促进作用，发酵后产品的色泽和口感等感官特征得到改善和 多样化，同时提高了营养物质降解率；如发明专利CN104232525A公开了"一种凝结芽抱杆 菌活菌制剂的制备工艺"，该专利报道了一种凝结芽抱杆菌活菌制剂的制备工艺，凝结芽抱 杆菌经一、二级种子扩大培养后接入发酵培养基中培养，在发酵过程中通过补料流加碳源 增加芽抱杆菌的数量和转化率，显著提高了产量，降低了成本。
[0009]目前有关凝结芽抱杆菌快速检测、芽抱制备及其活菌制剂制备方法已见专利报 道。但是，关于利用产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌制备活菌制剂的方法尚未见国内外相关 文献报道和专利报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制 备方法。
[0011] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0012] 本发明所设及的凝结芽抱杆菌度acillus coagulans)Liu-gl，分离筛选自传统干 酪中，已于2015年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称 CGMCC)，保藏号为：CGMCCNo.10790。在脑屯、浸液度HI)培养基上，凝结芽抱杆菌度acillus coagulans) Liu-gl的菌落大小为2~4mm，灰白色、不透明、表面湿润、边缘不整齐，菌落表 面初期（45°C，培养6~8h)扁平，后期皱權凸起；菌体细胞呈大杆状，长短不一，中生芽抱， G+好氧嗜热菌。
[0013] 所述方法中，采用单因素多水平和正交试验对凝结芽抱杆菌Liu-gl发酵培养基 配方进行优化，优化后的发酵培养基配方为（质量体积比浓度，W/V) :1%玉米淀粉，1%大 豆巧，0. 2 %碳酸巧，蒸馈水1000血，pH7. 5。
[0014] 所述方法中，在上述试验结果基础上，采用单因素多水平和正交试验进行凝结芽 抱杆菌Liu-gl发酵条件的优化。优化后的发酵条件为：发酵液初始抑7. 5,发酵时装液量 50血/250血S角瓶，接种量2%，发酵溫度45°C，摇床转速18化/min,发酵时间48h。
[0015]所述方法中，将上述1L优化发酵培养基装入化自动发酵罐中进行高密度分批发 酵，接种量为2 %，控制发酵溫度45°C，发酵液初始抑7. 5,揽拌转速180~22化/min,发酵 时间48h，得到凝结芽抱杆菌Liu-gl发酵液。
[0016] 上述方法中，5L自动发酵罐由上海高机生物工程有限公司生产，其型号为 BI0F6005GBN。
[0017] 所述方法中，在上述试验结果基础上，利用立式高速冷冻离屯、机将1L发酵液于 4°C条件下，500化/min离屯、20min，弃上清液，收集得到菌泥。
[0018] 所述方法中，立式高速冷冻离屯、机由湘仪离屯、机仪器有限公司提供，型号为 化-21M。
[0019] 所述方法中，将收集的菌泥加入到发酵液原体积1/10的含有10. 5%麦芽糊精、 4%马铃馨淀粉和5. 5%乳清粉（质量体积比浓度，W/V)冻干保护剂中，混合均匀后，得到凝 结芽抱杆菌Liu-gl与冻干保护剂的混合物。
[0020] 所述方法中，将上述混合物于-36°c低溫冰箱中预冻1化至完全冻结状态，得到预 冻活菌制剂。
[0021] 所述方法中，利用化LABC0NC0真空冷冻干燥机（美国）将预冻活菌制剂于冻干 溫度-55°C、真空度0.ISmBar的条件下，冻干4化至完全干燥状态，得到产中性蛋白酶的凝 结芽抱杆菌Liu-gl冻干活菌制剂。
[0022] 所述方法中，采用小试发酵生产技术和冻干工艺所得到的产蛋白酶凝结芽抱杆菌 Liu-gl活菌制剂的活菌数量可达到l〇iiC即/gW上，菌种存活率可达85%W上。
[0023] 上述方法得到的产中性蛋白酶凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备方法，W及 专用生产菌株属于本发明保护范围。
【具体实施方式】
[0024] 下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。
[00巧]下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。
[0027] 实施例1、产中性蛋白酶的凝结芽抱杆菌Liu-gl活菌制剂的制备 [002引1、菌种活化
[0029] 将凝结芽抱杆菌Liu-gl斜面或平板培养物接种于装有灭菌的5mLBHI培养基试 管中，于45°C转速为15化/min的摇床培养1化活化培养一代。而后W2%的接种量移种于 装有灭菌的5mL基础培养基试管中，于37°C转速为15化/min的摇床培养4化活化培养二 代，得到活化菌种。
[0030] 凝结芽抱杆菌Liu-gl基础培养基配方为（质量体积比浓度，W/V) :1%葡萄糖，1% 蛋白腺，0. 2%化C1，蒸馈水1000血，pH7. 0。
[0031] 2、发酵培养基配方的优化
[0032] (1)单因素多水平试验确定发酵培养基配方
[0033] 碳源的确定：将基础培养基中的碳源分别由葡萄糖、薦糖、可溶性淀粉、纤维素、麦 芽糖代替，将凝结芽抱杆菌Liu-gl活化菌种W2%的接种量移种于盛有50mL灭菌培养基 的250mLS角瓶中，于37°C转速为15化/min的摇床培养48h，采用平板计数培养基W倾注 法检测发酵液中的活菌数量，结果见表1。
[0034] 表1发酵培养基碳源对发酵液中Liu-gl菌株活菌数的影响
[0035]
[0036] 由表1可知，五种不同的碳源条件下，凝结芽抱杆菌Liu-gl的活菌数有差异，其中 葡萄糖作为碳源的活菌数最低，仅为3. 3X108CFU/mL;玉米淀粉作为碳源时活菌数最高，为 4. 53Xl〇9CFU/mL。故选取玉米淀粉为发酵培养基的碳源。
[0037] 氮源的确定：在确定碳源为玉米淀粉的基础上，将基础培养基中的氮源分别由花 生教皮、大豆巧、玉米教皮、棉巧巧、小麦教皮代替，w上述同样条件和方法进行发酵与活菌 计数，结果见表2。
[0038] 表2发酵培养基氮源对发酵液中Liu-gl菌株活菌数的影响
[0039]
[0040] 由表2可知，五种不同的有机氮源条件下，凝结芽抱杆菌Liu-gl的活菌数有差异， 其中玉米教皮作为氮源条件下的活菌数最低，仅为3. 0X107CFU/mL;大豆巧作为氮源时活 菌数最高，为2. 53X109CFU/mL。故选取大豆巧为发酵培养基氮源。
[0041] 无机盐的确定：在确定玉米淀粉和大豆巧分别为碳源和氮源的基础上，将基础培 养基中的无机盐分别由氯化钢、氯化巧、硫酸儀、硫酸儘、碳酸巧代替，W上述同样条件和方 法进行发酵与活菌计数，结果见表3。
[0042] 表3发酵培养基无机盐对发酵液中Liu-gl菌株活菌数的影响
[0043]
[0044] 由表3可知，在含有五种不同的无机盐发酵培养基中，凝结芽抱杆菌Liu-gl的活 菌数有明显差异，其中硫酸儘作为无机盐条件下的活菌数最低，仅为1. 〇Xl〇7CFU/mL;而碳 酸巧、氯化巧和氯化钢作为无机盐时活菌数均大于l〇9CFU/mU其中碳酸巧作为无机盐时活 菌数最高，为9. 33X10化即/血。此外，碳酸巧还具有调节发酵液抑的作用，故选取碳酸巧 为发酵培养基中的无机盐。
[0045] (2)正交试验优化发酵培养基配方
[0046] 根据单因素多水平试验结果，选择1%、2%、4%的玉米淀粉（碳源），1%、2%、4% 的大豆巧（氮源），〇.2%、0.4%、0.6%的碳酸巧（无机盐）设计^因素^水平比9(3 3)]正 交试验，W上述同样条件和方法进行发酵与活菌计数，结果见表4。
[0047] 表4优化凝结芽抱杆菌Liu-gl发酵培养基配方[U (33)]正交试验结果表
[0048]
[0049] 由表4极差分析可知，影响发酵液Liu-gl菌株活菌数的因素主次顺序为：C>B > A,即无机盐含量对活菌数的影响最大，氮源大豆巧含量对活菌数的影响相对略小，而碳 源玉米淀粉含量对活菌数的影响最小；由K值分析Kai>KA2>KA3,Kbi>Kb3>KB2,Kci>KC2 > Kc3可知，发酵培养基配方最优组合为AiBA，即碳源含量为1%，氮源含量为1%，无机盐 含量为