提高凝结芽孢杆菌出芽率及l-乳酸产量的发酵方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于饲料微生物技术领域，具体地说，涉及一种提高凝结芽孢杆菌出芽率 及L-乳酸产量的发酵方法。
【背景技术】
[0002] 微生态制剂是近年来国内外迅速崛起的新型益生菌饲料添加剂，具有调节肠道功 能、维持肠道菌群平衡、促进生长和提高机体免疫力等作用，且能够减少服用抗生素带来的 耐药性，对畜产品无毒无害，促进绿色饲料的最佳解决方案之一，已被广泛应用于畜牧养殖 业中。乳酸菌和芽孢杆菌目前在动物营养中研究及应用越来越多，乳酸菌具有抑制有害菌、 维持肠道菌群平衡及可定植等优点，但抗逆性差，不耐热，给菌种的加工、保藏都带来了一 定的挑战，芽孢杆菌由于芽孢的生成，具有抗逆性强、耐高温及易储存等特点，而产乳酸的 凝结芽孢杆菌同时具备两者的优点，具有广泛的开发及应用价值。
[0003] 凝结芽孢杆菌(Baci 1 lus coagulans)又称乳酸芽孢杆菌，细胞杆状，革兰氏染色 阳性，形成内生孢子，兼性厌氧，最适生长温度40_50°C，同型发酵产生乳酸。凝结芽孢杆菌 具有一般乳酸菌维持肠道微生态平衡，提高免疫及促进动物消化等作用，还具有耐高温、耐 酸耐胆盐等高抗逆性，市场前景十分广阔。
[0004] 凝结芽孢杆菌在有氧条件下发酵产芽孢，发酵过程中代谢出很少量的L-乳酸;在 厌氧静止条件下培养凝结芽孢杆菌能够产出纯度较高L-乳酸。乳酸是一种绿色健康食物， 它能够降低消化道PH，使肠道处于酸性环境，抑制病原菌生长，对肠道健康起到积极的作 用，哺乳动物和人类只含有L-乳酸脱氢酶，因此只能代谢利用L-乳酸。
[0005] 目前关于凝结芽孢杆菌的培养发酵研究主要集中在提高生物量、出芽率及发酵方 法等的研究，但是在相同条件下获得有更高含量L-乳酸的发酵产物同样具有重要的现实意 义，现有技术中几乎没有相关研究报道。本发明主要解决的技术问题为通过调整培养基成 分及发酵方法，在获得高生物量的凝结芽孢杆菌的同时，得到更多的L-乳酸，增强益生菌的 应用效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种提高凝结芽孢杆菌出芽率及L-乳酸产量的发酵方法。
[0007] 本发明的另一目的是提供采用上述方法制备的饲用活菌制剂。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明的一种提高凝结芽孢杆菌出芽率及L-乳酸产量的发 酵方法，其是通过向培养至对数期的发酵液中添加益生元的方式实现凝结芽孢杆菌发酵。
[0009] 本发明涉及的益生元包括葡萄糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖和低聚果糖，各种益生 元的添加量为葡萄糖5-8%、低聚木糖0.5-1 %、低聚异麦芽糖0.5-1 %、低聚果糖0.5-1 %。
[0010] 凝结芽孢杆菌发酵时所用发酵培养基组成为：豆柏粉1-5%、麸皮1-3%、酵母粉 0.5-2%、糖蜜2-5%、MgS〇4 · 7H2〇 0·卜0.2%、MnS〇4 · H2O 0.01-0.05%、Ca⑶30.2-0.4%、 K2HPO4O · 2-0 · 4%。优选地，发酵培养基组成为:豆柏粉1 %、麸皮1 · 5%、酵母粉0 · 5%、糖蜜 3%、MgS〇4*7H20 0.1%、MnS〇4*H20 0.01%、CaC030.4%、K2HP〇4〇.2%。
[0011] 本发明中涉及到的百分号"，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分 比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
[0012] 前述的方法，包括以下步骤：
[0013] 1)菌种活化；
[0014] 2)将活化菌种接种到发酵培养基中培养；
[0015] 3)待菌种生长至对数期，添加益生元，继续发酵12-30小时。
[0016]其中，步骤1)进行三级种子活化培养，活化培养基组成为：蛋白胨1 %、酵母粉 0 · 5 %、葡萄糖0 · 6 %、Κ2ΗΡ〇4〇 · 1 % ;活化培养条件为:40-50°C、pH值7 · 0，180-220rpm摇床培 养24h;三级种子活化培养的接种量均为5v/v%。
[0017]步骤2)具体为：将活化菌种按10v/v%的接种量接种到发酵培养基中，40-50°C 180-220rpm发酵培养36-48小时。
[0018] 步骤3)具体为:待菌种发酵至18-24小时，添加益生元，继续在40-50°C180-220rpm 的条件下培养至发酵结束。细菌生长到对数期时，菌含量几乎达到最高，活力最大，对外界 的影响因素也最敏感，此时添加益生元可促进L乳酸的产生。
[0019] 优选地，前述方法包括以下步骤：
[0020] 1)进行三级种子活化培养，活化培养基组成为:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、葡萄糖 0.6%、K2HP〇4〇. 1 % ;活化培养条件为:43°C、pH值7.0，200rpm摇床培养24h;三级种子活化培 养的接种量均为5v/v% ;
[0021] 2)将活化菌种按ΙΟv/v%的接种量接种到发酵培养基中，50°C200rpm发酵培养36-48小时；
[0022] 3)待菌种发酵至18-20小时，添加益生元，继续在50°C200rpm的条件下发酵至36小 时。
[0023] 本发明还提供按照上述方法制备获得的饲用活菌制剂。所述饲用活菌制剂中凝结 芽孢杆菌的活菌数在4.8\109(^11/1^以上，芽孢率在90%以上，且乳酸含量不低于30.5 8/ L〇
[0024] 本发明提供的发酵方法其最显著的优点是通过调整培养基成分及添加方式，实现 凝结芽孢杆菌的良好生长，提高凝结芽孢杆菌出芽率并且显著的提高了 L-乳酸含量，提高 了产品的质量和稳定性，同时在培养基中添加了益生元成分，使用该培养基培养的凝结芽 孢杆菌制剂可增强动物机体免疫力。使用本发明方法制备获得的饲用活菌制剂，凝结芽孢 杆菌的活菌数可达到4.8 X 109cfu/mL以上，芽孢率达90 %以上，乳酸含量不低于30.5g/L， 出芽率提高了 1 〇 %左右，乳酸含量提高了 2倍以上。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0026] 实施例1提高凝结芽孢杆菌出芽率及L-乳酸产量的发酵方法
[0027] (1)以凝结芽孢杆菌为发酵菌种，经三级种子活化后接种到发酵培养基中培养。
[0028] (2)活化培养基的组分包括:蛋白胨1 %、酵母粉0.5%、葡萄糖0.6%、磷酸氢二钾 0·1%〇
[0029] (3)活化培养条件均为：摇床培养、ΡΗ值7.0、温度为43°C、培养时间24h。三级种子 活化培养的接种量均为5v/v%。
[0030] (4)将活化好的凝结芽孢杆菌以ΙΟv/v%的接种量接种到发酵培养基中培养，发酵 体积为300L。
[0031] (5)发酵培养基的组分包括:豆柏粉1%、麸皮3%、酵母粉0.5%、糖蜜5%、MgS04 · 7H20 0.1%、MnS〇4*H20 0.05%、CaC030.2%、K2HP〇4〇.4%。
[0032] (6)在菌种培养至对数生长期，即在菌种培养至18h，在上述发酵培养液添加能促 进L-乳酸生成的益生元，所述益生元的添加量为:葡萄糖5%、低聚木糖0.5%、低聚异麦芽 糖0.5%、低聚果糖0.5%。
[0033] (7)在发酵培养过程中，搅拌转速设定为200rpm，培养温度50°C，发酵至36h