一种凝结芽孢杆菌固态发酵生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种凝结芽孢杆菌固态发酵生产方法。
【背景技术】
[0002] 凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans)在中华人民共和国农业部第1126号公告 《饲料添加剂品种目录》（2008)中已被列入保护期内的新饲料和新饲料添加剂，其批准使用 时间为2004年5月，适用范围为肉用仔鸡和生长育肥猪，说明其安全性、有效性、经济性和 对环境的影响已通过了全国饲料评审委员会评审，并得到农业部批准。美国FDA也已认可 其为"普遍认为安全"的杆菌类，且该芽孢杆菌在人类及动物生产上的应用研宄已成热点， 且效果显著。
[0003] 滥用抗生素可产生一系列的弊端，如破坏肠道微生态平衡、产生耐药菌株、造成畜 产品药物残留，严重威胁人类和畜禽的健康。因此，欧盟等国家已全面禁止抗生素饲料添 加剂在饲料中的使用。近年来研宄表明，益生菌（Prob-iotics)具有维持动物肠道菌群平 衡、改善动物肠道功能、提高机体免疫力及生产性能等作用效果，且能避免使用抗生素带来 的各种弊端，已广泛应用于食品、医疗、畜禽和水产养殖等领域。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans)是一种可以产生乳酸的益生菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，且抗逆性强，能 调节动物肠道微生态平衡，促进动物消化和提高动物免疫力等，因而已应用于饲料工业中。
[0004] 凝结芽孢杆菌虽有提高动物生产性能等诸多优点，但其作用效果并非一概而论， 不同生产厂家、不同活菌含量、不同饲用动物、不同使用阶段及制剂的稳定性等均影响其作 用效果，其中提高芽孢数、芽孢率和制剂的稳定性是发酵生产凝结芽孢杆菌的关键技术，也 是发挥其生物学作用的重要因素。目前所报道的凝结芽孢杆菌活菌数可达1〇 9?10ncfu/ mL，但其芽孢形成率并不高。戚薇等人和刘馨磊等人分别用中空纤维膜过滤法和补料分批 法高密度培养凝结芽孢杆菌，芽孢率分别为75%和26. 7%。
[0005] 近几年，微生态制剂的蓬勃发展，涌现了一批凝结芽孢杆菌生产厂家和研宄工作 者，但目前国内外的生产方式大都采用液体发酵工艺，然而液体发酵存在诸多缺点，如发酵 周期长、芽孢形成率低、后处理污水排放严重、成本高等问题，然而固态发酵生产方法，芽孢 数及芽孢率较高，工艺过程简单，投资少，操作容易，后处理简单等特点，已被广泛的接受和 研宄。针对于凝结芽孢杆菌的产业化，国内外学者对凝结芽孢杆菌液体发酵高密度培养进 行深入研宄，认为凝结芽抱杆菌经同型发酵生成的乳酸在发酵液中积累将造成pH值下降 及对菌体生长及芽孢的形成产生强烈的抑制作用，对于固态发酵来说，同样存在这样的问 题，如何更有效的提高固态发酵凝结芽孢杆菌芽孢数及芽孢率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提一种高产凝结芽孢杆菌芽孢数及芽孢率的固态发酵生产方法。
[0007] 根据本发明的方法包括以下步骤：
[0008] (1)一级种子制备：按1?10%的接种量，接入YPD液体培养基中进行培养，sp为 一级种子液。
[0009] (2)二级固态种子接种方法：将一级种子液调pH至6. 0?9. 0,按10%?90%的 接种量与固态料混合拌匀进行培养。
[0010] (3)三级固态种子接种方法：按1%?50%的接种量，取培养好的二级固态种子于 无菌水中，搅拌均匀，然后倒入固态料中拌匀进行培养。
[0011] (4)固态发酵接种方法：按1%?50%的接种量，取培养好的三级固态种子于无菌 水中，搅拌均匀，然后倒入固态料中拌匀进行培养，
[0012] 其中所述固态发酵料的配方按质量比包括：（1)主料，70?99%麸皮、1?30%豆 柏；（2)辅料，基于主料的质量包括0. 1?10%葡萄糖、0. 1?10%尿素、0. 1?10%碳酸 钙、0. 1?5%硫酸锰。
[0013]根据本发明的【具体实施方式】，本发明的高产凝结芽孢杆菌芽孢数及芽孢率的固态 发酵生产方法包括步骤：
[0014] (1) 一级种子制备：甘油管保藏菌种一支，按1?10%的接种量，取0. 1?1ml菌 液，接入Yro液体培养基中，在40°C、150r/min培养15?24h，即为一级种子液。
[0015] (2)二级固态种子培养基配制：按比例称取麸皮、豆柏，将0. 1?10%葡萄糖、 0? 1?10 %尿素、0? 1?10 %碳酸钙，溶于20?50% (对固态干料计）50?60°C热水中， 倒入称好的固态料中拌匀，121°C、灭菌50min。
[0016] (3)二级固态种子接种方法：将已灭菌的固态料自然冷却至50°C左右，同时将塑 料薄膜、固态发酵容器进行消毒灭菌，待固态料冷却后倒入容器中；使用已灭菌1?50%碳 酸钠，将一级种子液调pH至6. 0?9. 0,按10%?90%的接种量与固态料混合拌匀，置于 40?50°C培养间中培养15?24h。
[0017] (4)三级固态种子培养基配制：按比例称取麸皮、豆柏，将0. 1?10%葡萄糖、 0? 1?10 %尿素、0? 1?10 %碳酸钙，溶于20?80% (对固态干料计）50?60°C热水中， 倒入称好的固态料中拌匀，121°C、灭菌50min。
[0018] (5)三级固态种子接种方法：将已灭菌的固态料自然冷却至50°C左右，同时将塑 料薄膜、固态发酵容器进行消毒灭菌，待固态料冷却后倒入容器中；按1%?50%的接种量 取培养好的二级固态种子，倒入已灭菌水桶中，按比例20?80% (对固态干料计）加入无 菌水，搅拌均匀，倒入固态料中拌匀，置于40?50°C培养间中培养15?24h。
[0019]其中，固态发酵料配制：按比例称取麸皮、豆柏，将0. 1?10%葡萄糖、0. 1?10% 尿素、0. 1?10%碳酸钙、0. 1?5%硫酸锰，以上配料相对于麸皮和豆柏的质量添加，溶于 20?80 % (对固态干料计）50?60 °C热水中，倒入称好的固态料中拌匀，121 °C、灭菌50? 120min〇
[0020] 根据本发明的方法，其中，固态发酵接种方法：将已灭菌的固态料自然冷却至 50°C左右，将固态发酵容器进行消毒灭菌，待固态料冷却后倒入容器中；按1 %?50%的接 种量取培养好的三级固态种子，倒入无菌水中，无菌水按比例20?80% (对固态干料计） 添加，搅拌均匀，然后倒入固态料中拌匀，置于40?50°C培养间中培养48?72h后低温烘 干。
[0021] 本发明的高产凝结芽孢杆菌芽孢数及芽孢率的固态发酵生产方法工艺简单，去掉 了液体种子罐等设备的投资，节约了成本，采用固体逐级扩大生产，相比传统的固态发酵接 种量减少50% -95%，发酵期间pH值维持在7-8之间，并且菌数高，形成优势群菌进行发 酵，不容易染菌，芽孢数及芽孢率较高，芽孢数为1X109?1X10nCFU/g，芽孢率最高可以 达到99%，易于生产和推广。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1
[0023] (1) 一级种子制备：甘油管保藏菌种一支，取0. 5ml，接入一瓶YPD液体培养基中 (300ml/1000ml)，准备5瓶共1500ml种子液；40°C、150r/min培养17h，即为一级种子液。
[0024] (2)二级固态种子培养基配制：配制2. 5kg固态种子培养基：称取麸皮2250g、豆 柏250g混匀待用，称取葡萄糖25g、尿素50g、碳酸钙50g，溶于1250ml50?60°C热水中，倒 入称好的固态料中拌匀直到全部润湿，装入布袋中，系好，121°C、实验室灭菌锅灭菌50min。
[0025] (