4% NaCl、8% NaCl敏感，对1%乳酸钠、萘啶酸、亚碲酸钾、1% NaCl、氨曲南不敏感，能够在 pH5. 0、pH6. 0环境下生长。
[0023] (3) 16S rRNA序列分析和系统发育树的构建 利用细菌16S rRNA通用引物： 正向引物 27F :5' -AGAGTTTGAT CCTGG CTCAG-3'， 反向引物1492r:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'扩增目的基因。引物由生工生物工程 (上海）股份有限公司合成。以分离株JSSW-LA-07-1的基因组DNA为模板，PCR反应条件 为：94°C预变性 4 min;94°C变性 45 s、55°C 45 s、72°C 1 min，30 个循环；72°C修复延伸 10 min。取5 yL产物在含goldview染色剂的1%琼脂糖凝胶上电泳，150V、100mA、20min。 电泳结束后将凝胶放入凝胶成像系统，观察结果。PCR扩增产物交由生工生物工程（上海） 股份有限公司进行序列测定。菌株JSSW-LA-07-1的16S rRNA基因序列为SEQ ID NO: 1。
[0024] 将菌株JSSW-LA-07-1的16S rRNA基因序列与从GenBank中已知的核酸序列进行 Blast分析，挑选同源性较高的序列在Cluster X软件完成序列比对，比对结束后使用MEGA 4. 1软件构建系统发育树。
[0025] 菌株JSSW-LA-07-1基因序列测序结果16S rRNA基因长度为1466 bp，将菌株所 扩增的16S rRNA基因序列在NCBI通过Blast进行同源性检索，结果检索出为芽孢杆菌 属的16S rRNA基因序列，米用邻接法构建菌株分子发育树，分尚菌株在系统发育树上与 凝结芽孢杆菌（万aciWiAs (登录号：KM096994. 1)属同一支，同源性达99%以 上(见图1)。结合形态学和生理生化特征将所分离菌株鉴定为凝结芽孢杆菌 coagulans、。
[0026] 实施例3 :抑菌性测定 将无菌滤纸片在浓度为1. 〇 X 1〇7 CFU/mL凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1新鲜培养液中 浸泡1. 0 h。取浓度为5. OX 106 CFU/mL的水产养殖中常见致病菌嗜水气单胞菌、温和气单 胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌、大肠杆菌、 溶藻弧菌的液体培养液〇. 1 mL，分别涂布于LB琼脂培养基平皿上，然后将浸泡过菌液的滤 纸片贴于培养皿上，每个平皿贴3片，每个平皿做3个重复。平皿置于28 °C培养箱中24、 48 h，测量抑菌圈大小。测定结果如表1所示： 表1凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1抑菌性测定结果（抑菌圈直径:mm)
注表示无抑菌圈，纸片直径为7.00 mm。
[0027] 由表1可知，凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气 单胞菌、豚鼠气单胞菌、鳗利斯顿氏菌、爱德华氏菌、副溶血性弧菌均具有一定的拮抗作用， 其中对温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌的抑制效果最显著。
[0028] 实施例4 :凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备 菌株JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液，经lOOOOrpm高速离心发酵液收 集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2~10进行混合，在30~50°C下低温干燥20~ 24h，粉碎机粉碎，过0. 9mm筛，获得凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂浓度不低于 5· 0X108个（CFU) / 克。
[0029] 实施例5 :凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的养殖应用 试验用异育银鲫幼鱼采用循环流水控温系统进行养殖。试验选择健康、规格、重量基本 一致的异育银鲫，初始体重为（17. 7±0. 07) g的异育银鲫随机分为3组，每组3个平行，每 个平行30尾鱼。对照组饲喂基础日粮为鲫鱼商品料，由通威公司提供(表2)。试验日粮为 基础日粮分别添加1. 0~5. Omg *kg 1凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂（实施例4中 制备)。
[0030] 饲养管理：试验前，先用基础饲料驯养2周后进行正式试验。试验期间，每天投喂2 次（8:00-8:30,15:30-16:00)，直至表观饱食为止，日投饵量为鱼体重的3 %-4 %，并且根据 生长和摄食的情况作适当调整。每日定时测定水温、pH、氨氮、溶氧，养殖期间水温为26. 5°C 左右，pH7. 6~7. 8,溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0. 01 mg/L。待投喂试验日粮45d时称重等。
[0031] 表2异育银鲫基础日粮
表3饲喂凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂对异育银鲫幼鱼生长性能的影响 (n=3)
注：同一行数据中有不同字母表示差异显著（K〇. 05)。
[0032] 45d养殖结果表明：与对照组相比，在基础日粮中添加凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够显著提高鱼体的增重率、特定生长率（K0. 05)，并能够显著降 低饵料系数（代〇. 05)，存活率、肝体比、肥满度无显著差异（/M). 05)，结果表明摄食凝结芽 孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能显著提高异育银鲫的生长。
[0033] 实施例6 :凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂净化水质方面的应用 随机选取养殖青鱼池塘6个，3个为试验组，3个为对照组。试验组为按 50g/亩?米的用量全池泼洒凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，使进入水体中的 凝结芽孢杆菌起始菌浓约为102_103CFU/mL，连续泼洒一周。对照组为不泼洒凝结芽孢杆菌 JSSW-LA-07-1菌粉制剂。试验周期为1周，试验前、后分别采样，检测各项水质指标。
[0034] 表4凝结芽孢杆菌对养殖青鱼池塘水质的影响
注：同一行数据中有不同字母表示差异显著（代〇. 05)。
[0035] 从表4中可以看出，试验组各项水质指标较试验前均显著降低（K0. 05)，且明显 低于对照组（代〇. 05)。因此，可以说明凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂能够有效降低 水体中的污染物含量，改善养殖水质，能够作为水质净化剂应用于水产养殖。
【主权项】
1. 一株具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌，其分类命名为凝结芽孢杆菌 (ifeciWiAs 〇〇3济^<3/76·) JSSW-LA-07-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，保藏号为：CGMCC No. 10182。2. -种凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的制备方法，其特征在于以凝结芽孢杆 菌JSSW-LA-07-1为出发菌株，菌株JSSW-LA-07-1活化后经发酵培养得到的发酵液高速离 心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50°C下干燥20-24h，粉碎 机粉碎，过0. 9mm筛，获得的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂，浓度不低于5. OX 10s CFU/克。3. 用权利要求2所述方法制备的凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂的应用，其特征 在于：用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1. 0-5. Omg *kg 1的凝结芽孢杆 菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩?米的用量全池泼洒 凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1菌粉制剂。
【专利摘要】一种具有水产病原菌拮抗特性的凝结芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明菌株分类命名为凝结芽孢杆菌(<i>Bacillus？coagulans</i>)？JSSW-LA-07-1，巳保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC？No.？10182；还公开了该菌菌粉制剂的制备方法，以凝结芽孢杆菌JSSW-LA-07-1为出发菌株，该菌株活化后经发酵培养得到的发酵液高速离心收集湿菌体，湿菌体与干淀粉以质量比1:2-10进行混合，在30-50℃下干燥20-24h，粉碎机粉碎，过0.9mm筛，即得该菌菌粉制剂，菌粉制剂中菌浓度不低于5.0×108个（CFU）/克，该菌粉制剂用作渔业养殖饲料的添加剂，在饲喂基础日粮中添加1.0-5.0mg？?kg-1的该菌粉制剂；用作水产养殖水质改良剂，按50-200g/亩?米的用量全池泼洒该菌粉制剂。CGMCC No.1018220141215
【IPC分类】C12N1/20, C12R1/07
【公开号】CN105524855
【申请号】CN201510057403
【发明人】孙梅, 陈秋红, 张维娜, 夏飞, 高亮, 施大林, 匡群, 张宪中, 邹三元
【申请人】江苏省苏微微生物研究有限公司
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年2月4日