一种梅拉属菌株y-1及其用图
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及微生物领域，具体地说是一种梅拉属菌株Meira spp.Y-Ι及其对烟草 生长的作用。
【背景技术】
[0002] 土壤真菌（soil fungi)是指土壤中具有真核细胞的单细胞或多细胞分枝丝状体 或单细胞个体，属真核生物。土壤真菌以土壤作为活动场所完成其全部或部分生活史。广义 的土壤真菌还包括森林表土腐朽植物和枯枝落叶层上的真菌。常见者有藻菌纲 (Phycomycetes)、子囊菌纲(Ascomyctes)、担子菌纲(Basidiomycetes)及有性世代不明的 半知菌属(Fungi imperfecti)等。上述菌属大部分属于好气性腐生菌，有的则寄生在植物 上并有致病性。真菌的菌丝具有分解有机物的能力，而分生孢子和厚膜孢子却几乎没有这 种能力。真菌对土壤pH值的要求比放线菌和细菌所要求的为低。可以认为真菌是酸性土壤 中特别是森林土壤中的主要分解者。有许多土壤真菌是重要的植物病原菌，另外，还有与植 物共生的菌根菌，它们对植树造林起着重要作用。土壤真菌也参与动、植物残体的分解，成 为土壤中氮、碳循环不可缺少的动力，特别是在植物有机体分解的早期阶段，真菌比细菌和 放线菌更为活跃。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种新型的梅拉属菌Meira spp.及其用途，该菌 株能促进烟草生长。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种梅拉属Meira spp.菌株:保藏名称为： Meira spp. Y-1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学;保藏 日期：2015年 11月26日，保藏号：CCTCC N0:M2015704。
[0005] 本发明所提供的菌株，Meira spp.Y-1，其分类地位为：菌株Y-1属于真菌界 (Fungi)，双核亚界（Dikarya)，担子菌门（Basidiomycota)，黑粉菌亚门 (Ustilaginomycotina)，黑粉菌纲（Exobasidiomycetes)，外担菌目（Exobasidiales)，短担 菌科(Brachybasidiaceae)，梅拉属(Meira)。
[0006] 本发明的菌株Meira spp.Y-Ι(即Meira spp.Y-ICCTCC N0:M2015)具有如下特性： 在培养箱25°C条件下，PDA培养基上培养20天，菌落直径为2.0-2.2cm，表面凹凸，且具有白 色边缘;显微镜下观察可知，菌丝淡黄色透明，分生孢子梭形，同时菌落还产生褐色色素。
[0007] 本发明还同时提供了上述菌株的用途，促进烟草生长，尤其是中烟100的生长。更 为优选的，促进中烟1〇〇叶片增大，根系发达。
[0008] 本发明还提供上述菌株的用途，用于提高盆栽烟草中烟100烟叶中的总蛋白质含 量。
[0009] 本发明所涉及的菌株能取得以下有益效果：1、在中烟100烟草上使用，可以增长烟 草主根，增加侧根数量，增多根毛，增大叶面积和生物量。更进一步的，与不使用本发明菌株 的对照相比，烟草主根长度增加了 25.02%，侧根数量在第20天是对照的2.39倍，在第20天 鲜重是对照的4.68倍;2、在中烟100烟草上使用，提高烟叶中总蛋白质的含量。更进一步，本 菌株的使用可以提尚烟叶总蛋白质含量达10 %。
【附图说明】
[0010]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0011] 图1为Meira spp.Y-l菌株在PDA培养基上培养20天的形态；
[0012]图2为Meira spp.Y-l菌株扫描电子显微镜条件下的菌丝和分生孢子的形态；
[0013]图3为接种Meira spp.Y-l菌株在平皿上第20天对烟草的促生作用；
[0014]图4为接种Meira spp.Y-l菌株盆栽30天的烟草促生作用；
[0015]图5为接种Meira spp.Y-l菌株提高中烟100烟叶中总蛋白含量数据图。
【具体实施方式】
[0016] 实施例一、梅拉属菌株Meira spp.Y-l的分离
[0017] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA):配方包括马铃薯200g (去皮）、葡萄糖20g、琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL;其做法是马铃薯先洗净去皮，再称取 200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过 滤，加热，再据实际实验需要加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖， 搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至l〇〇〇mL，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（1.1个大气 压，121°C下灭菌20min)灭菌20分钟左右后取出冷却后贮存备用。
[0018] 水琼脂培养基(WA):琼脂粉20g、蒸馏水1000mL，进行常规的高温灭菌（1.1个大气 压，121°C下灭菌20min)。
[0019] 在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的菌株。
[0020] Meira spp.Y-l菌株是从我国贵州烟区烟草根系土中分离得到。将采到的土壤样 品收集带回实验室，过滤离心收集上清液，在无菌操作台上移接到PDA培养基上培养7天，获 得培养物后，在显微镜下挑取单孢子，接入PDA培养基，生长后获得纯培养物。
[0021]该菌为梅拉属菌株，进行了如下保藏:保藏名称为:Meira spp.Y-l，保藏单位：中 国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学;保藏日期：2015年11月26日，保藏 号:CCTCC N0:M2015704。本发明中的菌株Y-1，其分类地位如下：真菌界(Fungi)，双核亚界 (Dikarya)，担子菌门（Basidiomycota)，黑粉菌亚门（Ustilaginomycotina)，黑粉菌纲 (Exobasidiomycetes)，外担菌目（Exobasidiales)，短担菌科(Brachybasidiaceae)，梅拉 属(Meira)〇
[0022] 实施例二、梅拉属菌株Meira spp.Y-l的鉴定
[0023] 1、形态鉴定:将纯化的Meira spp · Y-1菌株转接到PDA培养基上，25°C培养20天，其 在平皿上的正面形态如图1所示。其形态特征为:在培养箱25°C条件下，PDA培养基上培养20 天，菌落直径为2.0-2.2cm，表面凹凸，且具有白色边缘;显微镜下观察可知(如图2所示），菌 丝淡黄色透明，分生孢子梭形，同时菌落还产生褐色色素。其形态接近担子菌门梅拉属真 菌。
[0024] 2、分子鉴定：
[0025] 1)真菌基因组DNA的小量提取
[0026] 提取缓冲液：含有 1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH=8.0。
[0027] 提取方法：
[0028] ①Meira spp.Y-1菌株在PDA平板上生长14天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入 已灭菌的含有500yL提取缓冲液1.5mL离心管中；
[0029] ②用电磨机将挑取的菌丝捣碎，9000rpm离心10min;
[0030]③吸取上清至另一离心管中，弃沉淀；
[0031 ]④加入等体积的异丙醇(分析纯），沉淀核酸，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心 lOmin；
[0032]⑤轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分；
[0033] ⑥加入800yL 70%乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min;
[0034] ⑦轻轻倒去上清液，在吸水纸上排干水分，置于37°C下15min，使乙醇充分挥发；
[0035] ⑧用50yL ddH20重悬沉淀，得到HZ-4基因组DNA，浓度达到30ng/yL。
[0036] 2)真菌18s Rdna基因的PCR扩增
[0037] 采用50yL反应体系进行PCR扩增，体系中含有：上下游引物各2yM，dNTPs 200μΜ， Mg2+1.5mM，10XPCR buffer 5yL，模版DNA 2yL，Taq酶2U。上游引物ITS序列为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3'，下游引物序列为5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' JCR扩增反应 在BIORAD S1000型PCR仪上进行。
[0038] 反应条件:94°C预变性2min，然后35个循环包括:94°C变性30sec，57°C退火40sec， 72°C延伸lmin。最后72°C后延伸lOmin。
[0039] 3)PCR产物的回收纯化：
[0040] PCR反应结束后，PCR产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用Axygen生物技术公 司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行。
[0041 ] 步骤如下：
[0042] (1)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管 中，称重；
[0043] (2)加入3倍体积的DE-A缓冲液，75°C保温lOmin，期间振荡数次，至完全融化。
[0044] (3)加入0.5个倍体积的DE-B缓冲液，混合均匀。
[0045] (4)将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心 lmin，弃上清。
[0046] (5)将DNA制备管放回2mL离心管中，加500yL缓