物之间无干扰现象，可准确扩增。
[00川实施例2
[007引引物特异性实验
[0073] -、实验方法
[0074] 1.DNA模板制备
[00巧]按照无菌操作要求，分别培养各类细菌并提取DNA。具体如下：
[0076]a.凝结芽抱杆菌标准株（CICC20138)、解淀粉芽抱杆菌和甲基营养型芽抱杆菌： 接种至凝结芽抱杆菌液体培养基，37°C恒溫静置培养36h，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模 板；
[0077]b.葡萄球菌、枯草芽抱杆菌和地衣芽抱杆菌：接种至LB液体培养基，37°C恒溫振 荡培养（180r/min) 2地，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板；
[0078]c.粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌：接种至MRS液体培养基中，37°C恒溫静置 培养2地，取2mL菌夜提取DNA，制备DAN模板。
[0079] 各株细菌DNA提取操作步骤如下：
[0080] (1)取培养的细菌菌液4mL，10 00化/min离屯、Imin，尽量吸尽上清液。
[00引]似向菌体沉淀中加入200μL缓冲液（称取20mg的溶菌酶溶解在1血TE缓冲液 中，制成终浓度为20mg/血的溶菌酶液，0. 22μm微孔过滤后保存备用），37°C处理40min。 [0082] (3)向管中加入20μLProteinaseK溶液，混匀。
[008引（4)加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70°C放置lOmin，溶液变清亮，简短离心去 除管盖内壁水珠。
[0084] 妨加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
[0085] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），1200化/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0086] (7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇），12 00化/ min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0087]做向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇），12OOOr/ min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[008引（9)重复操作步骤做。
[0089] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 0(K)r/min离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱 CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残留的漂洗液。
[0090] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100μL无菌双蒸水，室溫放置5min，12 0(K)r/min离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中。
[0091] 2.PCR扩增
[009引取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
[009引 PCR总体系为25 μ L各组分含量分别为：
[0094] 10XPCR Mix 12. η uL dd化0 9. 1 μ L· DNA模板 1。0 uL coag…F 0. 2 μ L ：coag~~R 0. 2 u L comK-F 1.0 μ L· comK-R 1,0 μ L·
[0095]反应程序：94°(：预变性1〇111111，94°(：变性3〇3,54°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，扩增 30个循环，最后72°C溫育5min。
[009引3.结果检测
[0097]取5μLPCR扩增产物，采用1 %的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳 45min，置于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
[0098]二、结果
[0099] 如图3所示，1号泳道为凝结芽抱杆菌标准株（CICC20138)的扩增结果；2-9号泳 道分别为解淀粉芽抱杆菌、甲基营养型芽抱杆菌、葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌、 粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和唾液乳杆菌的扩增结果。
[0100] 由图3可W看出，仅有凝结芽抱杆菌标准菌株（CICC20138)出现两条清晰条带， 大小分别约为345bp与769bp。虽然其他菌株能扩增得到一定条带，但所有对照菌株均不能 扩增到目的条带。
[0101] 本实例表明了本发明提供的检测方法特异性强，可W准确的将凝结芽抱杆菌与其 他芽抱杆菌或乳酸菌准确的区别开，特别是与凝结芽抱杆菌分子序列相似度较高的甲基营 养型芽抱杆菌与解淀粉芽抱杆菌。
[0102] 实施例3
[0103]引物灵敏性实验
[0104] 一、实验方法
[0105] 1.DNA模板制备
[0106] 按照无菌操作要求，将凝结芽抱杆菌标准菌株（CICC20138)接种于凝结芽抱杆 菌培养液体培养基，37°C恒溫静置培养36h，取2mL菌液提取DNA。细菌基因组DNA提取操 作步骤如下：
[0107] (1)取培养的细菌菌液4mL，10 00化/min离屯、Imin，尽量吸尽上清液。
[010引 （2)向菌体沉淀中加入200 μL缓冲液（称取20mg的溶菌酶溶解在1血TE缓冲液 中，制成终浓度为20mg/血的溶菌酶液，0. 22 μ m微孔过滤后保存备用），37°C处理40min。
[0109] (3)向管中加入20μLProteinaseK溶液，混匀。
[0110] (4)加入220μΙ缓冲液GB，振荡15s，70°C放置lOmin，溶液变清亮，简短离屯、，去 除管盖内壁水珠。
[0111] (5)加入220μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀。
[0112] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12 00化/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[011引 （7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前已加入无水乙醇），12 00化/min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0114](8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前已加入无水乙醇），12 00化/ min离屯、30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0115] (9)重复操作步骤（8)。
[0116] (10)将吸附柱CB3放回收集管中，12 0(K)r/min离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱 CB3置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残留的漂洗液。
[0117] (11)将吸附柱CB3转入一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 100μL无菌双蒸水，室溫放置5min，12 0(K)r/min离屯、2min，将溶液收集到离屯、管中。
[0118] 测定提取的细菌基因组DNA浓度，确定浓度后，对DNA样品依次按照10倍、20倍、 50倍、1〇2倍、10 3倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、1Q7倍进行稀释后，制备DNA模板。
[0119] 2.PCR扩增
[0120] 取步骤1所制备的DNA模板，用PCR扩增引物进行扩增。
[012。PCR总体系为25μL各组分含量分别为：
[0122] 10XPCR Mix 12. 5 μ ? dd 11,0 9. 1 μL DM模板 1.0 μL. coag-F 0. 2 μ I. coag-R 0. 2. p L comK-F 1.0 μ I. comK-R 1.0 μ I.
[0123]反应程序：94°(：预变性1〇111111，94°(：变性3〇3,54°(：退火3〇3,72°(：延伸1111111，扩增 30个循环，最后72°C溫育5min。
[0124] 3.结果检测
[012引取5 μ L扩增产物，采用1%的琼脂糖凝胶电泳，在恒压120V条件下电泳45min，置 于凝胶成像系统下观察PCR扩增结果。
[0126]二、结果
[0127] 凝结芽抱杆菌DNA浓度测定结果为78ng/μL因此稀释后浓度依次为7. 8ng/ μL、3.化g/μL、l. 56ng/μL、7. 8X10ing/μL、7. 8X10 2ng/μL、7. 8X10 3ng/μL、 7. 8 X10 4ng/μL、7. 8 X10 5ng/μL、7. 8 X10 6ng/μL。
[0128] 结果如图4所示，1-5号泳道均能出现清晰条带，5号泳道所对应的浓度为 7. 8X10 2ng/μL。因此可准确测定凝结芽抱杆菌的最低模板浓度为7. 8X10 2ng/μL。即使 用本发明提供的试剂盒检测待检样本可准确检测凝结芽抱杆菌浓度不低于1. 6Χ104c化/ mL的待检样品。
[0129] 本实例表明了本发明提供的凝结芽抱杆菌的检测方法灵敏度高。
[0130]
[0131]
【主权项】
1. 一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：包括以下步骤： (1) 提取样品DNA; (2)PCR扩增；所述PCR扩增以样品DNA为模板，用PCR扩增引物进行扩增；所述PCR 扩增引物包含两对PCR扩增引物，分别为引物对1和引物对2 ;所述引物对1为coag-F和 coag-R，引物对2为comK-F和comK-R;所述引物序列如SEQIDNO:1~4所示； (3) 结果检测。2. 根据权利要求1所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述步骤（2) PCR扩增包括PCR总体系的配置和PCR扩增反应。3. 根据权利要求2所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR总体 系容积为25μL，包括PCR扩增引物、PCR反应试剂（10XPCRMix)、DNA模板以及双蒸水。4. 根据权利要求3所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR总体 系中各组分含量为： 1QXPCR Mix 12.S PL del Π,Ο 9.1 μ L DNA 模板 1. 0 P L· coag-F 0.· 2 μ. 。 coag-R 0. 2 u L comK-F 1. Q μ L comK-R 1. Θ w L5. 根据权利要求2所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述PCR扩增 反应程序为：94°C预变性10min，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸lmin，扩增30个循 环，最后72°C温育5min。6. 根据权利要求1-5任意一项所述的快速检测凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于：所 述结果检测的方法为琼脂糖凝胶电泳。7. -种快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于：包含两对PCR扩增引 物，分别为引物对1和引物对2 ;所述引物对1为coag-F和coag-R，引物对2为comK-F和 comK-R;所述引物序列如SEQIDN0 :1~4所示。8. 根据权利要求7所述的快速检测凝结芽孢杆菌的多重PCR试剂盒，其特征在于：所 述试剂盒包含PCR反应试剂，阳性及阴性对照样品。
【专利摘要】本发明涉及一种芽孢杆菌的检测技术，提供一种快速检测凝结芽孢杆菌的方法及多重PCR试剂盒，该方法检测快速准确，敏感性高，且操作简单成本低。本发明提供的试剂盒和方法可以特异的扩增凝结芽孢杆菌基因组中的coag基因和comK基因序列，而不会扩增得到其他细菌的基因片段，特异性强。特别是与凝结芽孢杆菌分子序列相似度较高的甲基营养型芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌，不能扩增得到基因片段。能够准确、有效的检测出待检样品中是否存在凝结芽孢杆菌。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105256054
【申请号】CN201510782694
【发明人】苟小兰, 黄丹, 苏艳秋, 刘梅, 罗国强
【申请人】通威股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月13日