一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种对于五种口腔常见致病菌牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌多重PCR快速检测方法。
【背景技术】
[0002]人体口腔微生物群是一个极其复杂的生态系统，包括病毒，真菌，原生动物和细菌，其中以细菌数量多的，统计表明，每毫升唾液中约有I亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种，目前认为牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌之一，入血后黏附和侵入动脉血管壁所引起的局部炎症反应，被认为是加速心血管疾病(card1vasculardisease, CVD)动脉粥样硬化发生发展的重要原因之一；幽门螺旋杆菌作为人体口臭的重要原因，该菌与人体的胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病有密切联系；具核梭杆菌是口腔共生菌，但它有潜力致病，有时会引起牙周病，该菌也可能转移到肠道中，且其在肠道中的丰度与诱发性结直肠癌相关。变形链球菌的过度生长容易引发牙髓炎、尖周炎、牙周炎，其患者也可因菌血症而并发脑栓塞或者细菌性心内膜炎，金黄色葡萄球菌是口腔外感染一种主要致病菌，能够引起包括误吸性肺炎、感染性心内膜炎等口腔外感染疾病。
[0003]细菌的分离和培养是针对上述五种口腔致病菌最为传统的检测及鉴定方法，这种方法存在明显的缺陷，不仅培养条件和操作复杂，检测周期长，且特异性敏感性都受到很大的限制；随着分子诊断技术的发展，为人们提供多种特异、灵敏和快速的微生物检测方法，例如基于蛋白质水平发展起来酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)和蛋白质印迹法(Western Blot，WB)，针对特定微生物制备特异抗体，从而实现对微生物的高效灵敏检测，该方法较传统方法有一定的提高，但是存在较高的假阳性率风险，临床效果不佳；随着近年来PCR诊断技术的进步和成熟，PCR应用于微生物定性和定量检测领域越来越受到临床研究的重视，在传统PCR系统中，针对特异靶序列设计的寡核苷酸引物进而扩增特异产物并且结合应用于凝胶鉴定、测序分析，或者与限制性酶切技术或者RAPD技术结合可以对特定微生物进行准确、灵敏的鉴定分析，但该类型PCR不仅操作复杂，而且需要对PCR产物进行开管操作，容易引发污染，造成假阳性现象，而且这些类型PCR仅限于单次反应鉴定单个特异靶序列，并且如果需要实现多种口腔致病菌的检测则需要浪费大量的试剂和时间。
【发明内容】
[0004]为解决上述现有技术操作复杂、检测周期长、特异性灵敏性受限、假阳性出现率高、需开管操作、易引发污染、检测效率低、成本高等问题，本发明采用如下技术方案:
本发明提供一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测，具体包括以下三个步骤: 。I)在需要检测五种口腔致病菌特异靶序列的区域分别设计并制备五条改良的Taqman探针；
2)在每一个设计好的改良Taqman探针外围分别设计一对引物，包括一条上游引物和下游引物，用该对引物对特异靶序列进行单重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应；
3)实时荧光PCR扩增反应后进行熔解曲线分析，根据改良Taqman探针熔点的变化来判断待检测核酸序列是否存在以上五种口腔致病菌及其类型。
[0005]作为对本发明的改进，在步骤2)中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为单重单色PCR反应缓冲液，所述单重单色PCR反应缓冲液成分如下:
MgcI2I — 10 mM
dNTP0.05 — 1.5 mM
引物混合物0.05 — 2 μ M
探针混合物0.05 — 2 μ M
Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 模板 DNAI — 20 ul
总体积10_100 ul ο
[0006]作为对本发明的进一步改进，在步骤2)中，所述PCR扩增的多重多色反应体系为多重多色PCR反应缓冲液，所述多重多色PCR反应缓冲液成分如下:
MgcI2I — 10 mM
dNTP0.05 — 1.5 mM
引物混合物0.05 — 2 μ M
Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 探针混合物0.05 — 2 μ M
模板 DNAI — 20 ul
总体积10_100 ul ο
[0007]作为对本发明的进一步改进，所述引物混合物成分如下:
牙銀卟啉单胞菌的上游引物为5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙銀卟啉单胞菌的下游引物为5’ -tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’ -ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’ -tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’ -agagccttgctgtgggatta-3’，
所述引物混合物中，每一个引物其5’端均增加一段共同的核酸序列CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，其作用在于提高PCR的灵敏度，特异性，减少引物二聚体的产生(Brownie J , et al.Nucleic acids research, 1997, 25(16): 3235-3241.)。更为重要的是提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被Taq Polymerase切割，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。
[0008]作为对本发明的进一步改进，所述探针混合物成分如下:
牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -catcaccacataccacagatg-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’ -ctgcaacgtgaccattagcag-3’
具核梭杆菌的探针为 5’ -aaaatagcatactttacatattcatttt-3’
变形链球菌的探针为5’ -ttggaagagcacgtccaa-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’ -cactttagaattagtg-3’。
[0009]作为对本发明的进一步改进，所述改良Taqman探针是一种在低温状态下会形成颈环结构的荧光探针，长度为16-28个碱基，除环上的序列与靶互补外，其臂上碱基也与靶互补。
[0010]作为对本发明的进一步改进，所述改良Taqman探针在5’末端标记焚光基团或淬灭基团，在没有与把序列杂交时，改良Taqman探针自身形成颈环结构，使荧光基团和淬灭基团相互靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在与把序列杂交时，改良Taqman探针颈环结构解离，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收。
[0011]作为对本发明的进一步改进，所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如 ALEX-350，FAM, VIC, TET，CAL Gold 540，JOE, HEX，CAL FluorOrange 560，TAMRA, CAL Fluor Red 590，ROX, CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL FluorRed 635，Quasar670, CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705 等。
[0012]作为对本发明的进一步改进，所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE等。
[0013]本发明的有益效果在于:(I)寡核苷酸探针熔解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；(2)寡核苷酸探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析；(3)寡核苷酸熔解曲线克服在同一荧光通道仅能对其中一种口腔致病菌分析和检测的限制，根据改良的Taqman探针可以通过熔点的变化可在同一荧光通道来区分多种口腔致病菌特异靶序列；(4)在引物设计上其5端采用一段通用的寡核苷酸序列，其目的在于增加PCR的特异性外，还可以提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被Taq Polymerase切割，保证期在恪解曲线分析中具有足量探针参与反应，另一方面采用Fast Taq Polymerase，该酶被独特的双链DNA结合蛋白融合修饰，使其具有快速反应的特点使其5’端-3’端外切酶活性变弱，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。