游引物为5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙銀卟啉单胞菌的下游引物为5’ -tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’ -ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’ -tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’ -agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
[0026]所用的探针和引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
[0027]采用五种口腔致病菌全基因组DNA为:
牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌全基因组DNA由厦门基科实验室保存。
[0028]20 μ L 反应液中含 1X PCR buffer 2 yL(含 1.5 mM Mg2+)，2.0mM MgCl 2, 1mMdNTP, 10 pmol probe mix, 10 pmol 引物 mix，10 ng 五种口腔致病菌混合 DNA，5U FastTaq Polymerase0对该反应体系重复3次。对上述混合液进行PCR扩增，反应条件为:95°C预变性3min ;95°C变性5 sec，60°C保温3sec，72°C保温10 sec, 45循环；在反应后混合物进行恪解曲线分析，反应条件为:95°C变性lmin，40°C保温2min，随后按1°C /step的升温速率从40°C递增至80°C进行熔解曲线分析，并且采集FAM和HEX荧光信号。该实验在Rotor-gene Q实时PCR仪上进行。
[0029]结果见图3a和3b，可以观察到，在五种靶序列同时存在的情况下，设计的5对引物能够在混合DNA中PCR扩增出其所覆盖的靶序列区域。在PCR完成后，利用改良Taqman探针针对这些不同靶序列，分别形成稳定性不同的双链杂合体，不同靶序列在荧光通道和熔点均为独特的存在。在统一管内采集的熔解曲线中，其在FAM通道中，形成峰4和峰5两个独特的熔点，其在HEX通道中，形成峰1、峰2和峰3三个独特的熔点。对该反应体系重复
3次结果表明，该体系均能稳定的同时检测出以上5个独特的熔点峰。因此，采用多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法可以用于五种口腔致病菌同时检测。
[0030]实施例3考察人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在多重PCR后检测不同浓度具核梭杆菌质粒标准品的灵敏度。
[0031]本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，人工合成具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品，考察改良Taqman探针熔解曲线检测具核梭杆菌互补靶序列的检测灵敏度。
[0032]所用的改良Taqman探针为:
牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2_3’
幽门螺旋杆菌的探针为 5’ -HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2_3’
具核梭杆菌的探针为 5’ -HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2_3’
变形链球菌的探针为 5’ -FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2_3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’ -FAM-cactttagaattagtg-BHQ2_3’
所用的引物为:
牙銀卟啉单胞菌的上游引物为5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙銀卟啉单胞菌的下游引物为5’ -tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’ -ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’ -tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’ -agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
[0033]所用的探针和引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
[0034]人工设计具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品序列为: “CCAGCTGGCATTCCCTTTaaaatagcatactttacatattcattttgtttttgtgatataactgaatttt
ttaaaattctagcataataaatccattcaactgcaacaacagaaattatcatattacttattcctgcacctaacat
tccaactaataccatagctagtaaaaaacttggaaatgttgagaatatcatagtcaaccaatcaaaaaaactttctt
ctttccCTTGCCTCCAACCGATAAAA” 所用的探针、引物和具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品都在上海生工生物工程有限公司合成。
[0035]20 μ L 反应液中含 10Χ PCR buffer 2 yL(含 1.5 mM Mg2+)，2.5mM MgC12，15mMdNTP, 10 pmol probe mix，13 pmol 引物 mix，106 copies-100 copies 具核梭杆菌互补革巴序列的质粒标准品，5U Fast Taq Polymerase。对上述混合液进行PCR扩增，反应条件为:95°C预变性3min ;95°C变性5 sec，60°C保温3sec，72°C保温10 sec，45循环；在反应后混合物进行熔解曲线分析，反应条件为:95°C变性lmin，40°C保温2min，随后按1°C /step的升温速率从40°C递增至80°C进行熔解曲线分析，并且采集HEX荧光信号。该实验在Rotor-gene Q实时PCR仪上进行。
[0036]结果见图4和5可以观察到，图4的实时PCR扩增曲线表明，在具核梭杆菌互补革巴序列的106 copies-101 copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针都能给出较好的信号，在具核梭杆菌互补革E序列的100 copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针无法检测出荧光信号。在靶序列不存在的情况下，改良Taqman探针无法检测出荧光信号。而图4的恪解曲线分析表明，在具核梭杆菌互补革E1序列的106 copies-101 copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针能够在HEX通道形成独特一致的恪点。在具核梭杆菌互补靶序列的100 copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针无法形成熔点。在靶序列不存在的情况下，改良Taqman探针无法形成熔点。因此，采用多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法检测具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品的灵敏度可达101copies。
[0037]实施例4考察人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在采用不同的TaqPolymerase下含有以上三种口腔致病菌(具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌)检测临床口腔样本的能力。
[0038]本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，采用含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本，考察改良Taqman探针熔解曲线和不同TaqPolymerase对口腔致病菌临床口腔样本检测的能力
所用的改良Taqman探针为:
牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2_3’
幽门螺旋杆菌的探针为 5’ -HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2_3’
具核梭杆菌的探针为 5’ -HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2_3’
变形链球菌的探针为 5’ -FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2_3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’ -FAM-cactttagaattagtg-BHQ2_3’
所用的引物为:
牙銀卟啉单胞菌的上游引物为5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙銀卟啉单胞菌的下游引物为5’