熔解曲线分析的制作方法
【专利说明】熔解曲线分析 发明领域
[0001] 本发明涉及熔解曲线分析。具体地，本发明涉及一种方法，一种装置和一种用于分 析熔解曲线数据的信号描述的计算机程序。
[0002] 发明背景
[0003] 熔解曲线分析和高分辨率熔解(HRM)分析通常是用于检测和分析样品中的核酸序 列的存在的方法。通常在核酸的PCR扩增后，正常立即进行分析，并且该分析依赖于作为温 度函数的反应溶液监测荧光。所使用的荧光分子可以是双链D N A结合的荧光基团或荧光标 记探针。
[0004] 通常情况下，对于成功的HRM分析，需要几乎完全饱和的双链DNA结合荧光基团。这 一要求限制了可能的荧光基团的选择，因为其中它们中的许多将需要过高的浓度，而不允 许有效扩增。
[0005] 传统的HRM分析不是很好地适于进行定量分析。例如，在某些情况下，能够定量评 估在多相样品中的突变序列的相对丰度将是有益的。这种类型的信息例如在与癌症和非整 倍体分析相关的所获得单核苷酸多态性(SNP)分析中是有价值的。
[0006] 此外，传统的HRM分辨能力限制了它例如在检测纯合子SNP突变体中的使用，因为 熔解温度的差异是次要的。
【发明内容】
[0007] 因此，本发明的目的是提供一种分析技术，其适合核酸分子的定量分析，并能够以 良好的分辨率(在熔解温度差异方面)进行样品中核酸的检测和/或识别。
[0008] 本发明的目的是通过如由相应的独立权利要求所限定的方法、装置和计算机程序 实现的。
[0009] 在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线(melt curve)的新颖方法，其表征溶液 的熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所 述方法包括:获得在一定温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度;在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建模 成为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得荧光信号和模型化荧光 信号之间的差满足预定标准。
[0010]该方法可以包括将所述第三项的每一个建模成为在所述给定温度下用于相应核 酸分子种群的结合位置的总体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结 合位置的总体数量的占用水平的描述，其是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核酸分 子种群的熔解概率的描述，其是温度的函数，并且其中确定所述第三项的每个的值包括确 定所述第一和第二参数函数的参数值。
[0011]替代地或另外，该方法可包括由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函 数是所述第一类型未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，和由相应的第四 参数函数建模所述第四项的每个，所述第四参数函数是结合到相应的核酸分子种群的所述 荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，其中确定所述第二项的值包括确定所述第 三参数函数的参数值，并且其中确定所述第四项的每个的值包括确定用于相应第四参数函 数的参数值。
[0012] 数值分析可以包括在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，并采用 数值分析来确定在所述多个温度下其它项的值。所述设置可以包括设置所述第二项和每个 所述第四项为各自的预定值，并且所述采用可包括采用数值分析来确定第一项和每个所述 第三项的值，以能够确定溶液中一个或多个核酸分子种群的相对浓度和/或特性。可替代 地，所述设置可以包括设置所述第一项和每个所述第三项为各自的预定值，并且所述采用 可以包括采用数值分析来确定第二项和每个所述第四项的值，以能够确定所述第一类型荧 光基团的特性。
[0013] 所述核酸分子可以包括，例如，源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序 列，和/或所述荧光基团可包括多个下列荧光基团的一种或多种:LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09，SYBR Green。
[0014] 此外，在这方面，提供一种用于分析熔解曲线的新颖装置，其表征溶液的熔解，该 溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。所述装置包括 至少一个处理器和至少一个存储器，所述存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，至少一个存储器和计算机程序代码，其被配置为，与至少一个处理器一起，使该装置至 少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型 荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信号建 模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定温度 下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表示在 给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中，第一 信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型未结 合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发 射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第三项 表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项表示 在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值分析 来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模型化 荧光信号之间的差满足预定标准。
[0015] 此外，在这方面，提供了一种用于分析熔解曲线的新颖计算机程序，其表征溶液的 熔解，该溶液包含一个或多个核酸分子种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团。该计 算机程序包括一个或多个指令的一个或多个序列，当由一个或多个处理器执行时，其使装 置至少获得在一定温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一 类型荧光基团发射的作为温度的函数的光强度，以在该温度范围内的多个温度下将荧光信 号建模为第一信号分量和一组一个或多个第二信号分量的总和，第一信号分量表示在给定 温度下由溶液中的所述第一类型未结合荧光基团发射的组合光强度，第二信号分量分别表 示在给定的温度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度，其中， 第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，第一项表示在给定温度下所述第一类型 未结合荧光基团的相对数量，第二项表示在所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团 的发射效率，并且其中各第二信号分量被提供为相应的第三项和相应的第四项的乘积，第 三项表示在给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且第四项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和利用数值 分析来确定在所述多个温度下所述第一、第二、第三和第四项的值，使得第一荧光信号和模 型化荧光信号之间的差满足预定标准。
[0016] 该计算机程序可以体现在易失性或非易失性计算机可读记录介质上，例如作为计 算机程序产品，其包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质， 当由一个装置执行时，程序代码使该装置至少执行上文描述的用于计算机程序的操作。
[0017] 在本专利申请中提出的本发明的示例性实施例不应被解释为构成所附权利要求 适用性的限制。动词"包括"及其派生词在本专利申请中作为开放性限制被使用，其不排除 还未陈述特征的存在。除非明确声明，下文所描述的特征可以相互自由组合。
[0018] 这被认为是本发明特征的新颖性特征在所附权利要求中被具体阐明。然而，本发 明本身，既涉及它的结构和操作方法，又涉及其附加目的和优点，在结合附图阅读时，从具 体实施例的以下详细描述中将被最佳理解。
【附图说明】
[0019]图1示出了示例性恪解曲线。
[0020] 图2示出了作为时间函数的荧光基团发射效率的例子。
[0021] 图3示意性示出了荧光基团的结合的一个例子。
[0022]图4示出的示例性的熔解曲线。
[0023]图5a示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0024]图5b示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0025] 图5c示意性地示出了荧光基团在结合状态的变化的一个例子。
[0026] 图5d示意性地示出了结合状态的荧光基团的一个例子。
[0027] 图6示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0028] 图7示出了作为温度函数的熔解概率的一个例子和作为温度函数的结合位置的总 体数量的一个例子。
[0029] 图8示出了作为未结合荧光基团数目的函数的结合位置的占用水平的例子。
[0030] 图9示出了根据一个实施例的示例性方法。
[0031] 图10示出了作为温度函数的结合位置相对总体数量的一个例子。
[0032] 图11示出了作为温度函数的两个核酸分子种群的光强度的相对强度的荧光信号 分量描述的一个例子。
[0033]图12示意性示出了根据一个实施例的示例性装置。
【附图说明】
[0034]
[0035] 在本文中，术语荧光基团或荧光基团分子或染料用来指报告分子，其能够在第一 波长范围吸收光能，并且作为响应，在第二波长范围发射光能。
[0036]在本文中，术语核酸分子被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。 此外，术语靶可替代地被用来指DNA分子，RNA分子或它们的组合和/或衍生物。
[0037] 在本文中，术语种群被用于指一组类似分子。作为一个例子，术语种群可以用于指 一组相似的核酸分子或一组类似的荧光基团。此外，术语种群或术语子群可以被用来指代 一个子组，例如荧光基团种群的第一和第二子组。结合和未结合的荧光基团是子群的例子。
[0038] 在本文中，术语熔解曲线用来指信号或一组值，其描述在感兴趣的温度范围内作 为温度函数的溶液的熔解表现。作为熔解曲线适用的信号的一个例子是由感兴趣的溶液发 射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。熔解曲线信号的另一个例子是由包含核酸 和荧光基团的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度的函数。该值通常用图形表示。 [0039]在本文中，术语发射效率被用于指信号，例如用作熔解曲线的荧光信号的相对光 强度的幅度或相对幅度。
[0040]单链核酸分子、DNA和RNA，具有与使用核苷酸碱基的固有配对能力的第二链特异 性配对的能力，以形成双链结构。双链核酸分子具有特性变性（即从彼此链解离)温度，其依 赖于链的碱基序列。熔解温度（Tm)是二分之一的特定DNA双链体解离并成为单链DNA的温 度。引物-模板DNA双链体的稳定性也可通过其T m测定。
[0041 ]根据本发明的核酸分子是DNA或RNA或它们的任意组合，核酸优选是双链核酸分 子。在扩增反应或与第二核酸杂交产生双链结构后，单链核酸可以被分析。核酸分子可以是 任何类型的，如基因组DNA，mRNA(信使RNA)或siRNA(小干扰RNA)。核酸可以是天然存在的， 改性的或人造的核酸，其可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)被扩增。核酸分子可以包含， 或由任何类型的改性核酸组成。改性核酸的例子为吗啉代和锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、乙 二醇核酸、苏糖核酸和小沟结合剂。
[0042](待分析的）双链核酸分子可以是一种非扩增双链分子。如果该样品的核酸含量足 够高以允许检测，这是可能的。通常，核酸分子在使用PCR