于找到先前未 知的也可能相关的变体。而通常所有这样的显示出任何变化的标志的样品将必须用另一种 技术诸如定序进行确认，例如在筛选大量只包括少量具有变化的样本的情况下，按照本发 明的实施例的熔解曲线分析有可能节约成本，因为待测序样品的数量可显著减少。
[0156] 按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可实现基于靶定量的熔解曲线。作为一个 例子，基于扩增效率的方法已经在公开号W02010/128206A1中更彻底地被描述，其是在相同 的反应中使用相同的引物被扩增的相同扩增，并且具有几乎相同的序列。在该方法中，靶被 与具有几乎相同的序列的已知量片段混合。扩增后，两个靶的相对数量通过分析熔解曲线 数据进行评估。在W02010/128206A1中，熔解峰值必须相对良好地分离，以允许传统的熔解 曲线分析方法适应两个靶的熔解峰值。同样，标准系列的已知靶比率被需要，以校准分析系 统。相反，当使用根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于分析时，具有相关序列的靶的熔 点彼此更接近，使试验的设计更容易。对于W02010/128206A1的方法，具有尽可能相似的序 列也是有利的，因为相似性确保这两个目标相等的扩增效率，即相似的扩增效率对试验是 关键的。将根据本发明的实施例的熔解曲线分析用于量化也将消除为每一个不同类型的试 验运行标准系列的要求。
【主权项】
1. 一种用于分析熔解曲线的方法，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述方法包括： 获得在温度范围内熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述荧光基团发射 的作为温度函数的光强度； 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模成为第一信号分量和一组一个 或多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第 一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温 度下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量均被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三 项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述 第四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得所述荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。2. 根据权利要求1所述的方法，其中建模所述荧光信号还包括 将每个所述第三项建模为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数的值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用 水平的描述，所述第一参数函数是所述溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数的参 数值。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述第二参数函数被定义为：其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示用于相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。5. 根据权利要求2至4中的任一项所述的方法，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表不在溶液中的所述第一类型未结合焚光基团的相对数量，并且参数γ i表不 用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。6. 根据权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中建模所述荧光信号进一步包括： 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述第三参数函数被定义为：其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中，所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。8. 根据权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中利用数值分析包括 在所述多个温度下将所述项中的至少一项设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。9. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以能够确定 溶液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。10. 根据权利要求8所述的方法， 其中所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中所述采用包括采用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以能够确定 所述第一类型的荧光基团的特性。11. 根据权利要求1至10中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种类型的核酸分子 包括源自聚合酶链反应的一种或多种类型的DNA靶序列。12. 根据权利要求1至11中的任一项所述的方法，其中所述第一类型的荧光基团包括下 列多个基团之一：LC Green，LC Green+，Eva Green，SYT09,SYBR Green。13. -种计算机程序，包括一个或多个指令的一个或多个序列，其在由一个或多个处理 器执行时使得装置至少执行根据权利要求1至12中任一项所述的方法。14. 一种计算机程序产品，包括至少一个具有存储在其上的程序代码的计算机可读非 暂时性介质，所述程序代码，当由装置执行时，使所述装置至少执行根据权利要求1至12中 的任一项所述的方法。15. -种用于分析熔解曲线的装置，所述熔解曲线表征溶液的熔解，所述溶液包含核酸 分子的一个或多个种群和恒定数量的至少第一类型的荧光基团，所述装置包括至少一个处 理器和至少一个存储器，所述至少一个存储器包括用于一个或多个程序的计算机程序代 码，所述至少一个存储器和所述计算机程序代码被配置为，与所述至少一个处理器一起，使 所述装置至少执行以下内容： 获得在温度范围内的熔解曲线数据的荧光信号描述，荧光信号表示由所述第一类型的 焚光基团发射的作为温度函数的光强度， 在所述温度范围内的多个温度下将所述荧光信号建模为第一信号分量和一组一个或 多个第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由所述溶液中的所述第一 类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信号分量分别表示在所述给定的温度 下由结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团发射的组合光强度， 其中，所述第一信号分量被提供作为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在所述 给定温度下所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，所述第二项表示在所述给定温度 下所述第一类型的未结合荧光基团的发射效率，并且 其中每个第二信号分量被提供作为相应的第三项和相应的第四项的乘积，所述第三项 表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第 四项表示在所述给定温度下结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的发射效率;和 利用数值分析来确定在所述多个温度下所述第一项、所述第二项、所述第三项和所述 第四项的值，使得第一荧光信号和模仿的荧光信号之间的差满足预定标准。16. 根据权利要求15所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 建模每个所述第三项作为在所述给定温度下用于相应核酸分子种群的结合位置的总 体数量和第一参数函数值的乘积，所述第一参数函数是所述结合位置的总体数量的占用水 平的描述，所述第一参数函数是溶液中的未结合荧光基团的相对数量的函数， 其中所述结合位置的总体数量是由第二参数函数确定的，所述第二参数函数是相应核 酸分子种群的熔解概率的描述，所述第二参数函数是温度的函数，并且 其中确定用于每个所述第三项的值包括确定所述第一参数函数和所述第二参数函数 的参数值。17. 根据权利要求16所述的装置，其中所述第二参数函数是呈现S形形状的函数。18. 根据权利要求17所述的装置，其中所述第二参数函数被定义为其中T表示给定的温度，参数N1,〇表示在已经基本上发生任何熔解以前，相应核酸分子 种群的结合位置的总体数量，参数Tm, i表示相应核酸分子种群的平均熔解温度，并且参数〇1 表示相应核酸分子种群的熔解宽度，并且其中erf(x)是误差函数。19. 根据权利要求17或18所述的装置，其中所述第一参数函数被定义为其中，no表示在溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团的相对数量，并且参数丫1表 示用于相应核酸分子种群的填充平衡系数。20. 根据权利要求15至19中的任一项所述的装置，其中建模所述荧光信号还包括 由第三参数函数建模所述第二项，所述第三参数函数是所述第一类型的未结合荧光基 团的发射效率的描述，所述第三参数函数是温度的函数，和 由相应的第四参数函数建模每个所述第四项，所述第四参数函数是结合到相应的核酸 分子种群的所述荧光基团的发射效率的描述，所述第四参数函数是温度的函数， 其中确定用于所述第二项的值包括确定所述第三参数函数的参数值，并且其中确定用 于每个所述第四项的值包括确定用于相应第四参数函数的参数值。21. 根据权利要求20所述的装置，其中所述第三参数函数被定义为其中参数n〇表示所述第一类型的未结合荧光基团的相对基准发射效率，τ表示给定的温 度，并且参数το表示所述第一类型的未结合荧光基团的温度衰减系数，并且 其中所述第四参数函数被定义为其中参数m表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的相对基准发射效率，T表示 给定的温度，并且参数^表示结合到相应核酸分子种群的所述荧光基团的温度衰减系数。22. 根据权利要求15至21中的任一项所述的装置，其中利用数值分析来确定所述第一 项、所述第二项、所述第三项和所述第四项的值包括 在所述多个温度下将所述项的至少一个设置为预定值，和 在所述多个温度下采用数值分析确定其它项的值。23. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第二项和每个所述第四项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括采用数值分析确定所述第一项和每个所述第三项的值，以确定溶 液中的一种或多种核酸分子种群的相对浓度和/或特性。24. 根据权利要求22所述的装置， 其中，所述设置包括将所述第一项和每个所述第三项设置为相应的预定值，并且 其中，所述采用包括使用数值分析确定所述第二项和每个所述第四项的值，以确定溶 液中的所述第一类型的荧光基团的特性。
【专利摘要】提供一种用于利用荧光表征具有独特的Tm的诸如PCR产物的核酸分子的高分辨率率熔解曲线分析的方法。所述技术包括将原始熔解曲线数据建模称为至少两个信号分量的总和，第一信号分量表示由未结合/自由荧光基团发射的高强度，并且一个或多个第二信号分量表示由结合到双链DNA的荧光基团发射的组合光强度。数值分析被用来确定有助于总信号的不同分量的值，使得模型尽可能严密地匹配原始荧光数据。该方法使得即使在非饱和燃料浓度下仍能够提高靶合适的混合物的分辨率，因为考虑到从低温双链到在较高温度下熔解的双链的插入染料的再分配效果。
【IPC分类】G06F19/20, C12Q1/68
【公开号】CN105492624
【申请号】CN201380077243
【发明人】T·冯莱伯, J·库克拉, D·科昂
【申请人】恩姆菲舍尔科技公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2013年4月23日
【公告号】EP2989209A1, US20160085908, WO2014174143A1