征，某些类型荧光基团的特征可以随温度而变化，并且因此其发射效率可能会表现出对温 度更复杂的依赖性。或者，溶液可含有具有温度有关行为的猝灭剂分子。例如。在低温下猝 灭的荧光基团可以表明发射效率，按照根据公式(2)的参数函数，其是温度的函数。
[0067]
( 2 )
[0068] 其中所述参数τη表示由于分子间的碰撞，对于给定的荧光基团种群的发射效率衰 减系数，并且参数T2i表示由于淬灭发射效率的衰减系数，而公式(2)的其余参数表示与如针 对公式（1)所述相同的物理特性。按照公式(2)在给定温度下发射效率ru, tclt的温度描述的函 数的一个例子是由图2中的虚线曲线提供的。
[0069] 所研究的溶液通常包括一个或多个核酸分子序列的每一个的大量实例，换句话 说，该溶液可被视为包括一个或多个核酸分子种群，每个种群包括大量具有特征序列的相 应核酸分子。一个或多个双链核酸分子种群的每一个包含荧光基团可以结合的结合位置的 总体数量化，其中下标i表示相应的核酸分子种群。通常，对于给定的核酸种群，仅有结合位 置的总体数量化的一部分被占用。所占用的结合位置的数量被表示为m，并且因此占用水平 以rn/Ni表不。
[0070] 当给定的核酸分子种群熔解时，其结合位置的总体数量K随着温度的升高而降 低，并在同一时间给定的核酸分子种群从其结合位置释放荧光基团。因此，给定核酸分子种 群的结合位置的占用水平m/Ni也改变。这种现象在下文中更详细地讨论。从给定核酸分子 种群释放的荧光基团成为未结合荧光基团，结合到溶液的另一核酸分子种群的荧光基团或 结合到溶液的相同核酸种群的另一结合位置的荧光基团。因此，从给定核酸分子释放的荧 光基团从给定核酸分子的结合位置到别的地方改变位置，但不从溶液中消失，因此，溶液中 的荧光基团的总体数量n tclt保持恒定，尽管给定核酸分子群种熔解。因此，在溶液中的荧光 基团的总体数量ntot可以例如由公式(3)表示：
[湖]
⑶
[0072] 其中参数n〇(T)表不在温度T卜浴液中的未结合荧光基团的数量，参数m(T)代表在 温度T下结合到核酸分子种群i的荧光基团的数量，并且参数Ntgt表示在溶液中的核酸分子 种群的总体数量。因此，参数n〇(T)可被认为是未结合荧光基团的种群相对大小的指示，而 参数m(T)可被认为是结合到核酸分子种群i的分子的荧光基团种群的相对大小的指示。
[0073]图3通过在给定温度T下指示未结合荧光基团的种群310,结合到第一种群核酸分 子的荧光基团种群320和结合到第二种群核酸分子的荧光基团种群330示意性示出了此模 型。在该图示中，黑色圆圈表示结合到相应核酸分子种群的荧光基团，而白色圆圈表示在第 一和第二种群320,330的核酸分子内的未占用结合位置。因此根据图3的示例，在给定温度 T，有22个未结合荧光基团，10个结合到第一种群320的核酸分子的16个结合位置的荧光基 团，因而提供10/16 = 0.625的占用水平，以及13个结合到第二种群330的核酸分子的20个结 合位置的荧光基团，从而提供了 13/20 = 0.65的占用水平。
[0074] 图4示出了用于溶液的示例性熔解曲线，所述溶液包括第一种群320和第二种群 330的核酸分子，熔解曲线从50°C延伸至100°C。在温度1^ = 601,并且通常在第一种群320 的核酸分子发生任何熔解之前，结合位置的总体数量和与其结合的荧光基团数量是在图3 的示例中所示的那些，即沁=16，111 = 10，犯=20并且112 = 13。在温度12和/或在温度了2周围， T2是第一种群320的核酸分子的平均熔解温度，由于熔解，第一种群320的核酸分子开始放 松结合位置，即NKhpNKTs)。因此，一些结合到第一种群320的核酸分子的荧光基团成为 未结合焚光基团310,并且它们中一些进一步结合到第二种群330的核酸分子。在温度T2和/ 或温度T 2周围荧光基团结合状态的这种变化在图5a中示意性地被示出。
[0075] 在温度T3,第一种群320的核酸分子已经完全熔解，并且因此失去了所有的结合位 置，= 而在Τ4具有平均熔解温度的第二种群330的核酸分子仍然继续具有初始的 结合位置的总体数量，即Ν 2 = 20,并且在本实施例中，与其结合的荧光基团的数量为η2=17。 在温度Τ3和/或温度Τ3周围的荧光基团的结合状态在图5b中被示意性地示出。
[0076] 此外，在温度T4和/或温度T4周围，T4是第二种群330的核酸分子的平均熔解温度， 第二种群330的核酸分子由于熔解开始放松结合位置，即N 2(T3)>N2(T4)。因此，一些结合到 第二种群330的核酸分子的荧光基团成为未结合荧光基团310。荧光基团的结合状态在温度 Τ4和/或温度T4周围的这种变化在图5c中被示意性地示出。最后，在温度!^，第二种群330的 核酸分子也已经完全熔解并且因此失去了它们的所有结合位置，即Ν 2(Τ5)=0。因此，该溶液 的所有荧光基团都成为未结合荧光基团310。在温度T#P/或温度1~ 5周围的荧光基团的结合 状态在图5d中被示意性地示出。
[0077] 给定的核酸分子种群的熔解过程可以由熔解行为的概率密度函数描述来建模，其 是时间的函数，特别是在熔解温度Tm>1和/或在熔解温度T m>1的周围。作为一个例子，核酸分 子种群i的熔解概率可以被假定遵循正态分布，因此熔解概率可以被表示为温度的函数，成 为高斯概率密度函数
[0078] (4)
[0079] 其中T表示温度，参数NM表示在已经基本上发生任何熔解之前，种群i的核酸分子 的结合位置的总体数量，参数T m>1代表种群i的核酸分子的熔解温度，并且参数〇1代表核酸 分子种群i的熔解宽度。熔解温度T m>1和熔解宽度〇1是表征核酸分子种群的参数，并且因此 这些参数可以例如被用于识别核酸分子种群。
[0080] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0081] C 5 )
[0082] 其中erf〇是误差函数，如本领域已知的，其表现出S形。误差函数erf〇被定义为
[0083]
[0084] 根据公式(4)，作为温度函数的熔解概率通过图6中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，〇1 = 3°C，而图6中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根据式 (5)，其是温度的函数。
[0085] 适于建模核酸分子种群i的熔解的概率密度函数的另一实例是逻辑概率分布，其 根据
[0086] ( 6 )[0087] 因此，用于核酸分子种群i的结合位置的总体数量可以通过累计概率分布来获得
[0088] (7)
[0089] 个例子。
[0090] 根据公式(6)，作为温度函数的熔解概率通过图7中左侧的曲线所示的例子被示 出，其中Tm>1 = 75°C，并且〇1 = 3°C，而图7中右侧的曲线描绘了相应数量的总体结合位置，根 据式(7)，其是温度的函数。
[0091] 本文所描述的正态分布和逻辑分布用作合适的概率密度函数的非限制性例子，该 函数可以被应用以基于参数函数建模熔解概率。此外，相应的累计概率分布用作合适的S型 函数的非限制性例子，用于建模结合位置的相应的总体数量，其是温度的函数。在这方面， 概率密度函数可以应用不同于公式(5)和(7)中所采用的S型函数的S型函数，例如累计学生 t分布，反正切，双曲正切以及多个代数函数。因此，已知类型的另一分布或甚至任意分布与 合适的相应累计分布函数一起可以被应用。分布的类型可以是先验已知的，或分布的类型 可基于所测得的数据，例如基于熔解曲线或其导数被确定或近似。
[0092] 如在之前已经简要地指出的，对于种群i的核酸分子，仅结合位置的总体数量化的 一部分被占用。通常，占用水平取决于溶液中的未结合荧光基团数量。因为，如上所述，当温 度达到或超过它们的熔解温度时，溶液中的核酸分子释放荧光基团，并且所述链彼此分离， 溶液中的未结合荧光基团的数量取决于温度，并且因此占用水平mUVNdT)也至少间接地 依赖于温度。作为一个例子，种群i的核酸分子的占用水平ηΚ?/ΝΚΤ)可以使用参数函数被 建模，该参数函数为未结合荧光基团数量的指数函数，
[0093]
( 8 )
[0094] 其中参数n〇(T)表示在温度T溶液中的未结合荧光基团的数量，参数γι代表了用于 种群i的核酸分子的填充平衡系数。填充平衡系数取决于所使用的荧光基团，并且可以因此 独立于核酸分子种群，即公式(8)中的参数丫 1可以由适用于所有核酸分子种群的参数γ来 代替。图8中的实线曲线示出了占用水平ndlO/NdT)的一个例子，根据公式(8)，其是未结合 荧光基团的数量的函数。种群i的核酸分子的占用的结合位置的数量m(T)以及因此与其结 合的荧光基团的数量可以基于公式(8)被解决，其为
[0095：
( 9 )
[0096] 由于在溶液中的荧光基团的总体数量ntclt保持恒定，将公式(9)代入公式(3)能够 通过相应的结合位置的总体数量表示结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量，并 因此将公式(3)重写成
[0097]
( 1〇)
[0098] 作为另一个例子，种群i的核酸分子的占用水平mUVNdT)可以用参数函数来建 模，该参数函数是进一步涉及谐波振荡的未结合荧光基团数量的指数函数，为：
[0099]
[0100] 其中X =。而公式（11)的其它参数在公式(8)的上下文中被描述。图8中的 虚线曲线示出了占用水平rnUVNdT)的一个例子，根据公式（11)，其是未结合荧光基团数 量的函数。因此，公式（11)可通过结合位置的相应总体数量，例如在公式(3)中沿针对公式 (9)如上所示的线，来表达结合到溶液中的各核酸分子种群的荧光基团数量。
[0101] 虽然公式(8)和（11)所提供的参数函数的非限制性示例适于建模占用水平m(T)/ NKT)为未结合荧光基团数量的函数，不同于这些的函数，甚至是任意函数也可以被应用。 [0102]之前的描述已经假设，所研究的溶液设置有单一类型的荧光基团，因此具有依赖 于它们的结合状态的类似行为，并为温度的函数。然而，可以使用两种或更多种不同类型的 荧光基团以获得熔解曲线数据的相应两个或多个荧光信号描述。而根据例如在图3和图5a 至5d的上下文所描述的模型，单个结合位置被假定为能够一次仅结合给定类型的单个荧光 基团，它可以假设单个结合位置能够同时结合不同类型的两个或多个荧光基团。
[0103]优选地，不同类型的荧光基团发射不同波长的光，以有利于源自不同类型的荧光 基团的光之间的区分。此外，不同类型的荧光基团在发射效率上可呈现不同的变化，其是温 度的函数，和/或DNA靶结合位置的占用水平的不同进化，其是在所研究的溶液中的未结合 荧光基团的数量的函数。而荧光基团行为的前一方面可以例如基于公式（1)或(2)被建模， 发射效率模型的参数是针对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。类似地，虽 然核酸分子行为的后一方面可以例如基于公式(8)或（11)被建模，占用水平模型的参数针 对两种或多种类型的荧光基团中的每一种是不同的。因此，使用两种或多种不同类型的荧 光基团用来提供熔解曲线数据的两个或多个荧光信号描述，该荧光信号描述至少部分相互 独立，因此，提高了分析的精度和可靠性。
[0104] 适于建模包含一个或多个核酸分子种群的溶液特性的示例性公式被描述，为了描 述的清楚和简便起见，其使用荧光基团作为报告分子的一个例子，该荧光基团响应于通过 具有合适特性的光的激发，在其特性波长发射光。但是，在这方面，荧光基团用作合适的报 告分子的非限制性例子。
[0105] 在一般情况下，所研究的溶液可以被提供有任何报告分子，当其结合状态改变时， 其改变其可测量性质中的一个或多个。作为这方面的另一实例，可以应用依赖于其结合状 态改变其电-化学势的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由从溶液中测量的电化学势的信 号描述来表示，其是温度的函数。作为进一步的例子，可以应用依赖于其结合状态改变从其 发出的热能的报告分子。因此，熔解曲线数据可以由溶液发射的热能的信号描述来表示，其 是温度的函数。作为再一示