一、第二、第三和第四项的确定的值的组，可被选择来表示 溶液的熔解，其提供了与相应荧光信号的更好匹配。
[0135] 在下文中，通过描述单个计算或模拟轮，基于例如在示例性方法900的情况下的熔 解模型，提供了熔解特性的计算示例。
[0136] a)通过将所采用版本的熔解模型的所有参数设定为期望的值，开始一轮模拟/计 算。例如，如果应用根据公式（16)的熔解模型，荧光基团的总体数量n tclt，未结合荧光基团的 发射特性的参数描述(nm)，结合到核酸分子的各种群的荧光基团的发射特性的参数描述 (丫：^^丄用于核酸分子的各种群的熔解参数⑴^~几一以及核酸分子种群的总体数 量(N tgt)被设置为期望值。
[0137] b)根据本实例，作为数值分析的第一计算步骤中，在感兴趣的温度范围内作为温 度的函数的结合位置的总体数目NJT)被确定。这例如可以在公式(5)的基础上进行。作为 这方面的一个例子，图10示出了用于溶液的结合位置的相对总体数量化")的曲线描述，所 述溶液包括核酸分子的两个种群(标有"靶Γ和"靶2"，即N tgt = 2)，其中用于核酸分子的两 个种群的熔解参数是
[0138] Tm, i = 75°C，Tm,2 = 90°C，〇1 = 〇2 = l°c，Νι,ο = 1 · 7，N2,o = 1 · 5。
[0139] c)作为该实例接下来的步骤，用于各核酸分子种群的结合位置的计算总体数量化 (T)被采用，其和溶液中的荧光基团的总体数量11_保持恒定，而与温度无关(参照公式(3)) 这一事实的知识一起，来基于公式（10)计算未结合荧光基团的数量n〇(T)。虽然未结合荧光 基团的数量η〇(Τ)在一般的情况下不能使用分析方法基于公式（10)得到解决，本领域中已 知的数值方法，如牛顿迭代，可以被用来确定no (Τ)。因此，使用ntclt，Ni (Τ)，NtgjP γ i的值的 知识，m(T)的值可以例如在公式(9)的基础上被解决。作为这方面的一个例子，图10还示出 了作为温度函数的未结合荧光基团的相对数量n〇(T)的曲线描述。
[0140] d)作为本实施例的最后步骤，第一信号分量Fo(T)，第二信号分量FKT)和所产生的 建模的焚光信号F(T)被确定。这可以被实现，由于发射特性(％，T〇，ru，Ti)的参数描述也被 设置为期望值，相应的发射效率可例如基于公式（1)被确定，并且建模荧光信号分量Fo(T) 和?"! 1)可以根据公式（14)导出。作为这方面的一个例子，建模的荧光信号F(T)可与所得到 的荧光信号进行比较，并且其间的差或相似性可通过使用合适的预定成本函数进行评估。 图11不出了信号分量Fi(T)，其表不由本实例的核酸分子的两个种群的每一个(标记为"革巴 Γ和"靶2"）及其总和（"测量的信号"）所发射的光的组合强度，其中用于核酸分子的两个种 群的熔解参数与图10的情况下相同，并且发射特性的参数描述为1() = 50^1^ = 0.01， =^2=1,111 = 112 = 1^1=12 = 5014 0
[0141] 在上面的例子中，在步骤a)中的设置的期望的参数值可以表示用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的值，并且因此通过a)至d)的单个模拟/运算轮可足以确定 用于其余项和/或参数的值。
[0142] 作为另一实例，在步骤a)中设置的期望参数值中的一些可以是用于熔解模型的各 项和/或参数的已知和因此预定的参数值，而其它期望的参数值是应用于给定模拟/计算轮 的未知项和/或参数值的候选值。因此，从a)至d)的多个模拟/计算轮可能被需要来测试候 选值的所有期望组合，同时保持已知参数在整个模拟轮中处于它们的预定值，以评估各模 仿的荧光信号F(T)和所观察到的荧光信号之间的匹配。一旦所有期望的组合已被模拟，得 到模仿的荧光信号F(T)与观测到的荧光信号之间的最佳匹配的候选值(和预定参数值）的 组合被选择以代表熔解。
[0143] 作为这方面的一个例子，发射特性(no, TQ，ru，Ti)的参数描述在整个模拟轮可能具 有已知的并且因此预定的值，而其余参数，包括用于核酸分子的各种群的熔解参数(T m,η σηΝΜ)以及核酸分子种群的总体数量Ntgt可能具有由模拟来确定的未知值。作为这方面的 另一个例子，用于核酸分子的各种群的熔解参数 (Tm i，〇i，Ni Q)以及核酸分子种群的总体数 量Ntgt和它们的相对浓度在整个模拟轮中可能具有已知并且因此预定的值，而发射特性 (ri 〇，TQ，rU，Ti)的参数描述可具有由模拟来确定的未知值。在进一步的示例方案中，熔解模 型的所有参数可以被认为是未知参数，可能需要大量模拟/运算轮。
[0144] 在一个情况下，其中熔解模型的多个项或参数具有未知值，可能有利的是，限制各 候选值的范围和/或数量，以减少分析过程的复杂性并增加结束于正确和有意义的结果的 可能性。候选值可在所述情况下例如基于典型值的先验知识被选择。作为另一示例，所观察 到的荧光信号的特性或熔解曲线数据整体可以被用于选择例如用于熔解温度Tmu和熔解宽 度〇 1的候选值的适当范围。作为一个具体的例子，如果假定在图1中所示的整体熔解曲线， 可以看到，由于该整体熔解曲线的急剧下降，核酸分子的一个或多个种群的熔解看起来好 像发生在75°C及其附近，并且更进一步，核酸分子的一个或多个种群的熔解发生在90°C及 其附近。因此，该数值分析可以被限制为例如仅考虑用于参数UP 〇1的值，连同Nu的适当 相应值，其中参数UP〇1的值在75°C附近和90°C附近的适当温度子范围内，并且通过假定 核酸分子的1，2, ...，Nmax种群在两个温度子范围熔解，以避免用于这些参数的值的考虑，这 种考虑看起来无论如何不可能提供具有能观察到荧光信号的适当模型。
[0145]按照本发明的实施例的熔解曲线分析可被使用的一个实际例子是典型的SNP检测 情境，其中所研究的样品可以是对于感兴趣的SNP的纯合或杂合的。在纯合的情况下，基因 组中的靶的两个副本在感兴趣区域是相同的并且靶DNA包括两条互补链。在杂合的情况下， 在感兴趣的区域内存在两种不同类型的序列。最初，当杂合样品未被扩增时，这两个不同的 序列都包括互补链，但在变性和/或扩增后，这四个不同链可以导致两个原始同源双链和两 个新创建的异源双链的不匹配的方式配对。典型的是两异源双链比任一原始同源双链具有 显著降低的T m。因此，有可能的是，当两个不同的异源双链熔解时，四个分离链可以形成两 个同源双链。在根据本发明的实施例的熔解曲线分析方面，这意味着，当两个单独的异源双 链核酸种群熔解时，自由的单链核酸链可以形成具有相应结合位置的两个新型同源双链体 核酸种群。因此，当温度变化时，靶的数量N tgjP所述靶的相应种群可以改变。如果有必要， 根据本发明的实施例的熔解曲线分析可将这种从一个种群到另一个种群的转变纳入考虑。
[0146] 应用于示例性方法900的情况下，例如以实现通过a)至d)的一个或多个模拟/运算 轮的数值分析，基本上可以应用本领域中已知的任何数值分析方法。适用的方法的非限制 性实例包括，Levenberg-Marquardt算法，其也被称为阻尼最小二乘法，高斯-牛顿算法，梯 度下降法，内尔德-米德法，共辄梯度法，随机搜索法等。
[0147] 在根据公式（12)至（16)的任一个的模型的应用中，感兴趣的温度范围优选覆盖从 温度范围的下端到温度范围的上端，该温度范围的下端低于所研究溶液中的任何核酸分子 种群的熔解，该温度范围的上端高于所研究溶液中的任何核酸分子种群的熔解温度。从50 °C延伸到高达100°C的温度范围通常足以覆盖感兴趣的核酸分子种群的熔解行为的分析。 然而，延伸至低于50°C的温度和/或高于100°C的温度的温度范围可以被应用。可替代地，鉴 于熔解行为的预先知识，感兴趣的更集中的温度范围可以被应用。在这方面，感兴趣的温度 范围通常至少覆盖整体熔解曲线的至少陡降部分，其通常表明一个或多个核酸分子种群的 熔解，以保证捕捉完整熔解行为以及因此所研究的溶液中任何熔解基本已发生之前的情 况，以能够确定包括在溶液中的核酸分子种群的初始相对浓度。
[0148] 作为非限制性的进一步的例子，图12示意性地示出了示例性装置1200,其可被用 于实施上文所描述的熔解曲线分析方法900或其变型。该装置1200包括处理器1210和存储 器1220,处理器1210被配置为从存储器1220读取和写入到存储器1220。装置1200还可以包 括通信接口 1230,诸如网络卡或网络适配器，使得能够与一个或多个其它装置进行无线或 有线通信。该装置1200还可以包括用户接口 1240,用于提供数据、命令和/或其它输入到处 理器1210,和/或用于从处理器1210接收数据或其它输出，用户接口 1240包括例如显示器、 一个或多个键、键盘、鼠标或相应定点装置、触摸屏等中的一者或多者。装置1200可以包括 图12的实例中没有示出的其它部件。
[0149] 虽然处理器1210在图12的例子中被提供为单个部件，处理器1210可以被实现为一 个或多个单独的部件。虽然存储器1220被示为单个部件，存储器1220可以被实现为一个或 多个单独的部件，其中的一些或全部可以被集成/可移除和/或可以提供永久/半永久/动 态/高速缓存的存储。
[0150] 该装置1200可以被实施为具有足够处理能力的专用或通用设备。可替代地，装置 1200可以被实施为专用于实施上文所述的熔解曲线分析方法或其变型和与熔解曲线分析 相关的可能方法或功能的装置。
[0151] 存储器1220可以存储计算机程序1250,其包含当被加载到处理器1210并由处理器 1210执行时，控制装置1200的操作的计算机可执行指令。作为实例，计算机程序1250可包括 一个或多个指令的一个或多个序列。该计算机程序1250可以被提供为计算机程序代码。处 理器1210能够通过从存储器1220读取包括在其中的一个或多个指令的一个或多个序列，来 加载和执行该计算机程序1250。一个或多个指令的一个或多个序列可以被配置为，当由一 个或多个处理器执行时，引起装置，例如装置1200,执行上文所描述的熔解曲线分析的方法 或其变型。
[0152] 因此，装置1200可以包括至少一个处理器1210和至少一个存储器1220,其包括用 于一个或多个程序的计算机程序代码，至少一个存储器1220和计算机程序代码，其被配置 为与至少一个处理器1210-起，使装置1200执行上文所述的熔解曲线分析方法或其变型。 [0153]计算机程序1250可以独立于装置被提供，并且该计算机程序1250可以经由任何合 适传输机构在装置1200处被提供。作为一个例子，所述传输机构可以包括至少一个具有存 储于其上的程序代码的计算机可读非暂时性介质，和程序代码，当被装置执行时，其使装置 至少执行处理以实施前述熔解曲线分析方法或其变型。传输机构例如可以是计算机可读存 储介质，计算机程序产品，存储器装置的记录介质，诸如CD-R0M、DVD，相应的光学介质，有形 地体现计算机程序1250的制造制品等。作为进一步的例子，传输机构可以是配置成可靠地 传送计算机程序1250的信号。
[0154] 参照处理器不应被理解为仅包括可编程处理器，而是也可以包括专用电路，诸如 现场可编程门阵列(FPGA)、专用电路(ASIC)，信号处理器等。在前面的描述中描述的特性， 可以明确描述组合之外的组合被应用。虽然功能已经参照某些特征被描述，这些功能可以 通过已经描述的或未描述的其它特征执行。虽然特征已经参照某些实施例被描述，这些特 征也可以存在于已经描述的或未描述的其它实施例中。
[0155] 作为一个例子，本发明的实施例可以适用于促进与癌症的诊断或预知相关的已知 基因组的特定区域内的变体的基因分型。样品DNA将优选进行纯化，之后，它的区域或一部 分将通过使用例如PCR扩增。PCR步骤可以被优化以即使在dsDNA结合荧光基团存在下也发 生，实现实时监测扩增，为内部质量控制检测失效扩增，和熔解分析，而不需要打开该试管 用于任何其它试剂的添加。在PCR步骤后，扩增产物将能够在相同的仪器内，通过运行熔解 曲线分析技术被分析。由于所使用的染料的特性将是已知，根据本发明的实施例的熔解曲 线分析为在扩增样品中识别不同分子的数量和它们的比例提供了有力的工具。除了识别先 前已知的突变变体的存在，按照本发明的实施例的熔解曲线分析也可以应用