利用高分辨熔解曲线分析技术检测ugt2b7基因多态性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术和医学检验领域，尤其涉及一种利用高分辨熔解曲线 分析技术检测药物代谢酶UGT基因多态性的方法。
【背景技术】
[0002] 药物进入人体经过吸收、分布、代谢和消除后排除体外，药物与其相关的药物代谢 酶、转运蛋白及作用靶点相互作用，编码代谢酶和靶点蛋白的基因和药物效应密切相关。如 果这些基因发生突变，就可以引起药物反应的遗传差异。通过药物相关基因检测来预测患 者是否对治疗药物敏感，从而筛选出最适合的药物，提高药物的疗效，降低药物的毒副反 应。基因检测指导个体化用药对提高临床疗效和保证用药安全有重要意义，基因多态性可 作为不同患者个体用药的参考指标。
[0003] 葡萄糖酸酸基转移酶（UDP-glucuronosyhransferase，UGT)存在于许多脊椎动物 的肝微粒体中，是最重要的Π 相生物转化酶之一，UGT催化多种内源性物质和许多临床应 用的药物（如非留体抗炎药、吗啡、化疗药物表柔比星、抗癫痫药物卡马西平和丙戊酸盐、 免疫抑制药物麦考酚酸、抗病毒药物齐多夫定等）。UGT存在明显的个体差异和种族差异， 通过检测其基因多态性可以预测药物的反应，如FDA伊立替康说明书中注释需要检测UGT 1A1*28的多态性，UGT 1A1*28纯合子患者需要调整给药剂量以预防嗜中性白血球减少症 的发生。UGT2B7基因是UGT家族中的重要成员之一，主要定位于4ql3,全长16kb，包含6 个外显子和5个内含子，可编码529个氨基酸残基。研宄表明UGT2B7基因的编码区和启动 子区域存在着高度的遗传多态性，如_327A>G，-161T>C，-138G>A和-125T>C。研宄表明， UGT2B7是卡马西平和丙戊酸葡萄糖醛酸化的主要同工酶，UGT2B7C. 802T>C(rs7439366)多 态性可能通过影响UGT酶的活性影响药物的代谢，其基因多态性影响药物浓度，从而影响 药物的疗效。因此，检测UGT2B7C. 802T>C多态性对个体化给药有重要的临床意义。
[0004] 目前现有的基因多态性的检测方法主要有Taqman探针法和DNA直接测序法。 Taqman是高度特异的定量PCR技术，其优点是步骤少，不易污染，便于对大样本进行分型； 但对引物设计有一定的限制，对于SNP附近的序列有一定要求，受突变碱基位点与类型局 限。DNA直接测序法是突变检测的金标准，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样 本进行检测。除以上两种常用方法外，市场上已经出现一些基因产品，罗氏公司的基因芯片 产品--NimbleGen AccuSNP CYP基因分型芯片，利用芯片技术对于已知位点的突变进行 快速分型，是目前基因芯片的热点应用之一，基因芯片快速、准确、简便，实验报告为定性， 缺点是价格昂贵，高达几百美元，且无法同时处理大量样本。
【发明内容】
[0005] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。
[0006] 本发明的目的是提供一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法一高分辨 恪解曲线分析（high-resolution melting analysis, HRM)技术测定UGT2B7基因多态性的 方法，该方法具有高通量、高灵敏度、重复性好、操作简便和低成本的特点，对协助个体化给 药、保证用药安全和有效具有重要意义。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明的第一个方面是提供一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测UGT2B7 基因多态性的方法，其特征在于，提取DNA后经PCR扩增，再用高分辨熔解仪检测 UGT2B7C. 802T>C(RS7439366)基因分型。
[0009] 在上述方法中，优选地，所述方法包括以下步骤：
[0010] 步骤1 :查找目的基因 UGT2B7C. 802T>C(RS7439366)的DNA序列，对该目的基因的 突变位点设计筛选合适的引物对；
[0011] 步骤2 :提取外周血细胞样本的基因组DNA，利用步骤1筛选的引物进行基因 PCR 扩增；
[0012] 步骤3 :利用高分辨熔解曲线分析技术对扩增后的目的基因的突变位点进行检 测。
[0013] 在上述方法中，优选地，所述引物对含有目的基因靶序列中18-27bp连续核苷酸 构成的序列，PCR产物长度为80-150bp ;其中，UGT2B7C. 802T>C(RS7439366)引物序列为：
[0014] RS7439366-F ：ATGGGGAAAGCTGACGTATG ；
[0015] RS7439366-R :TTACCTTAGGCAGGGGTTTG。
[0016] 在上述方法中，优选地，所述步骤2的PCR扩增反应的条件为92_97°C预变性 3-15min，92-97°C 变性 10-30s，50-65°C 退火 10_30s，72°C 延伸 10-30s，70-75°C 继续延伸 3-10min，进行30-50个循环。
[0017] 在上述方法中，优选地，所述步骤3的检测选用SYT0-9饱和荧光染料，以已知 UGT2B7C. 802T>C(RS7439366)位点三种基因型的样本DNA为对照，参照对照样本高分辨熔 解曲线，以判断样本的基因多态性。
[0018] 在上述方法中，优选地，所述步骤3的检测条件为92-97°C变性2-4min，40°C复性 l-2min ;然后初始熔解温度60-65°C开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测 荧光信号，25-45次每秒；然后40°C进行冷却5-15s ;其中，UGT2B7C. 802T>C熔解曲线温度 设定范围为78-84 °C。
[0019] 在上述方法中，优选地，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括 引物、DNA聚合酶、dNTPs、MgCl 2、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料。
[0020] 其中，所述dNTPs优选地为包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP的混合液；所述荧光染料 优选为SYT0-9饱和性染料。
[0021] 本发明的第二个方面是提供一种预测药物反应的方法，采用如上所述方法检测 UGT2B7的基因多态性。
[0022] 在上述方法中，优选地，所述药物包括但不限于非留体抗炎药、吗啡、化疗药物表 柔比星、抗癫痫药物卡马西平和丙戊酸盐、免疫抑制药物麦考酚酸、抗病毒药物齐多夫定。
[0023] 本发明应用一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法--高分辨熔解曲 线分析（high-resolution melting analysis，HRM)技术，该技术是近年国外兴起的一种全 新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含 量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性 和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。因此，该方法可以应用于样品突变、 单核苷酸多态性、甲基化、HLA配型等分析。HRM方法具有高通量（1次检测可完成384个样 本测定）、高灵敏度（试验中无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型 的局限）、特异性高（闭管操作，避免污染造成的假阳性）、操作快速简便（在60-90分钟内 完成检测，检测速度快、操作简便、适合临床常规监测）和低成本的特点，随着高精度PCR仪 (LightCycler? 48〇 和 Rotor-Gene 6000)和饱和染料（LC Green、Eva Green 等）的出现， 使HRM技术的广泛应用。
[0024] 目前，应用HRM测定UGT2B7基因多态性的方法未见报道。因此开发出高效、灵敏、 准确的检测上述单核苷酸多态性的方法，对协助个体化给药、保证用药安全和有效有重要 意义。
[0025] 本方法无需昂贵的设备和试剂，操作不需要进行酶切、纯化等步骤，避免人工接触 有毒有害试剂和紫外照射等，安全性较好，并且真正实现了闭管操作，