Ibv、csfv和ndv的高分辨熔解基因分型的制作方法
【专利说明】IBV、CSFV和NDV的高分辨膝解基因分型
[0001] 相关申请的香叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月18日提交的美国临时申请61/738, 688的优先权。
技术领域
[0003] 本发明设及使用高分辨烙解技术区分和表征IBV、CSFV和NDV毒株和鉴定新毒株 的方法。本发明还提供随该类方法使用的底物和试剂盒。
[0004] 发明背景
[0005] 聚合酶链反应（PCR)是一种引物延伸反应，所述反应提供一种在体外扩增特定 DNA或多核巧酸、产生数千个至数百万个特定DNA序列副本的方法。PCR现在是医学研究实 验室和生物学研究实验室中用于多种应用的常见和经常不可替代的技术。该些应用包括用 于测序、基于DNA的系统发生或基因功能分析的DNA克隆；诊断遗传疾病；鉴定遗传指纹； 及检测和诊断传染病。基本PCR的某些变型包含定量实时PCR(qPCR或RT-PCR)、等位基因 特异性PCR、非对称PCR、热启动PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、连接介导的PCR、序列 间特异性PCR、热不对称交错PCR和温度递降PCR。该些PCR变型针对不同用途提供广泛类 型的用途。例如，可W通过等位基因特异性PCR鉴定单核巧酸多态性（SNP) 〇)NA中的单碱基 差异）、qPCR可W在PCR反应中扩增的副本数目提供极高精度炬artlett等人，"A化ort HistoryofthePolymeraseChainReaction"，PCRProtocols, 2003)。
[0006] 最近，增加了高分辨烙解（HRM)法作为一种用于高通量突变扫描的新分子技术 狂hou，L.等人，Clin.Chern.51，1770-1777, 2005)。使用HRM确定突变基于与双链DNA 相互作用的巧光染料存在下暴露于递增温度时DNA的解离（参见，例如US7, 387, 887 ; US7, 582, 429)。本领域中存在许多适宜的染料。突变的存在导致DNA异源双链体形成，随 后烙解行为改变。因此，该种"突变扫描"技术检测祀基因衍生的PCR扩增子中序列变异的 存在。在HRM实验中，首先在高分辨烙解染料存在下借助实时PCR扩增样品DNA。该类染料 的知名实例在W0 2008/052742中公开。在PCR后，后续烙解实验可W在同一个实时仪上进 行，并用相应的基因扫描软件分析W鉴定序列变体。
[0007]经典猪癌（CSF)，先前称作猪霍乱，是一种侵袭家猪和野猪的高度接触性和多系 统出血性疾病，它在全球养猪业中造成经济损失并且根据陆生动物卫生法典，是世界动物 卫生组织法定报告疾病（0IE，2007)。致病因子是经典猪癌病毒（CSFV)，它是一种有囊膜、 正义、单链RNA病毒，归属于黄病毒科（Flaviviridae)的癌病毒属（Pestivirus)。在遗传 水平，基于E2基因和NS5B基因的部分序列，CSFV可W划分成基因型1、2和3。每个基因 型可W划分成亚基因型，分别称作1. 1、1.2和1.3 ;2. 1、2. 2和2. 3 及3. 1、3. 2、3. 3和 3. 4(Paton等人，VetMicrobiol. 73:137-157, 2000)。在亚洲，CSF流行性是普遍存在的， 并且已经在几个亚洲国家分离基因型1、2和3。
[0008]CSFV可W引起急性、亚急性和慢性猪病，并且对全球养猪业造成重大威胁，造成严 重经济损失。CSF的控制设及根除或接种，其中根除是在发达国家如欧盟巧U)的优选控制 方法，因屠宰感染猪造成庞大数量的损失。在另一方面，接种是在发展中国家如中国的主要 控制策略。猪癌兔化病毒（肥LV)(也称作C株）在二十世纪五十年代中期开发并且在中国 和许多国家广泛使用（Moorman等人，JVirol. 70:763-770, 1996)。用肥LV疫苗大规模接 种造成在接种的猪群中难W区分CSFV的野生型株和肥LV株（VanOirshot,VetMicrobiol 96:367-384,2003)。CSFV亚临床感染和无症状感染是普遍存在的（Moennig等人，Vet. J. 165, 11-20,2003 ;Tu，VirusRes. 81，29-37, 2001)，产生无法由农民和兽医师可容易识别 及无法通过一般检测法如病毒分离、抗原捕获化ISA和巧光抗体试验可检出的野生型CSFV 感染。
[0009] 已经开发各种诊断测定法。然而，它们全部具有局限性。病毒分离需要6-12日 W证实结果；ELISA并不非常敏感并经常产生假阴性结果；实时PCR测定法更快和更敏 感，但是受交叉污染高风险限制并且是最重要的。该些测定法均不能够区分CSFV的野生 型毒株和疫苗毒株。之前，已经在抓建立了区分野生型CSFV与"化ems"疫苗毒株的实 时RT-PCR测定法（Leifer等人，J.Virol.Methods158, 114-122, 2009;Leifer等人，J. Virol.Methods166, 98-100, 2010;Leifer等人，J.Gen.Virol. 91，2687-2697, 2010)，并且 在韩国开发了一种区分野生型CSFV和"K-LOM'疫苗毒株CSFV的测定法（化o等人，CanJ VetRes70:226-229,2006)。在中国，已经描述了一种基于探针结合位点处核巧酸差异区 分野生型CSFV与肥LV-株疫苗的两步骤实时RT-PCR测定法和一种使用小沟结合（MGB)探 针结合检测野生型中突变的单步骤实时RT-PCR测定法（wt-rRT-PCR)。
[0010] 不太可能的是可在全部国家中使用一种通用检测法，因为不同CSFV疫苗株已经 在不同国家施用，例如，在抓施用"Riems"，在韩国施用"K-L0M"，而在中国施用"肥LV"。因 此，需要开发一种实惠、易于执行并易于解释结果W区分经典猪癌野生型和疫苗型的测定 法。
[0011] 传染性支气管炎（IB)是一种在全部国家养禽业流行的疾病，在大部分地区发生 率接近100%。它是经济上最重要的疾病。在维鸡中，呼吸道疾病或肾炎导致死亡、增重 下降和加工时非难，而在产蛋期鸡中，该种疾病为亚临床的并导致产蛋量下降和异常蛋 (I即jatovic等人，ArchivesofVirology, 2006)。IB暴发持续在接种鸡群中出现，主要地 因为认为IB暴发由不同的IBV血清型、亚型或变体引起，所述血清型、亚型或变体因S1基 因的核巧酸点突变、插入、缺失或重组生成。
[0012] 致病因子，传染性支气管炎病毒（IBV)属于冠状病毒科（Coronaviridae)。它 是一种有囊膜正义单链RNA病毒，基因组长度27. 6化。前20化编码病毒RNA依赖性 RNA聚合酶和蛋白酶。整个基因组从5'至3'具有至少10个可读框（OR巧并如下： 5' -la-化-S(S1、S2)-3a、b、C巧)-M-5a、b-N-Poly(A)-3'，编码 4 种结构蛋白，包括纤突糖 蛋白做、膜糖蛋白（M)、磯酸化核衣壳蛋白㈱和小的膜蛋白似（Mardani等人，Arch Virol.155(10):1581-6, 2010)〇
[001引IBV于1930年首次在美国报道并且自此W后已经在遍及W下四大洲的 大部分国家报道：美洲（Johnson和Marquar化,AvianDis. 19:82-90, 1975)、欧洲 (Capua等人，Zenha化 1Veterinarmed6.41:83-89, 1994 ;Cavana曲和Davis,Arch Virol130:471-476, 1993 ;Gou曲等人，VetRec. 130:493-494,1992)、亚洲（Wang 等人，AvianDis41:279-282, 1997)和大洋洲（I即jatovic和McWaters,JGen Virol. 72:2915-2922, 1991 ;Lo虹，AvianDis. 20:478-482, 1976)。在马来西亚，关于本疾 病的流行率知之甚少。IB病的首次报道早至1967年，病情温和并且接种无保障（化ong等人，SecondsymposiumonScientificandTechnologicalResearchinMalaysia andSingapore，第 73-83 页，1967;Aziz等人,The8化VeterinaryAssociation MalaysiaScientificCongress, 23-25化August1996,Ipoh,第 76-78 页）。变体已经 自至少 1979 年起存在（Lohr,Proceedingsofthe1 曰tInternationalSymposiumon InfectiousBronchitis,EFKaleta&U.Heffels-Redmann(Eds),第 70-75 页，1988 ; deWit等人，Avian化thology. 40(3) :223-235, 2011)，在 1980 年首次报告了 一个毒 力更强的毒株，所述毒株引起导致高死亡率的肾病-肾炎综合征化eng等人，Kajian Veterinar. 12:1-8, 1980;Aziz1996)。与马来西亚IBD相关的最近发表回溯至2000 年、2004年和2009年，自1995年起临床报道了肾病变型变异IBV毒株（Maizan，2002 年 8 月 28 日-28 日，Proceeding12化FAVAand14化VAMcongress第 116 页；Yap M.L等人，2000 年 9 月 1 日-4 日ProceedingVAMCongress;Arshad等人，J.Vet. Malaysia. 14Q&2): 322002;Ba化is等人，ProceedingsVAMCongress2004,Zulperi等 人，VirusGenes. 38:383-391,2009)。
[0014] 世界范围内，已经鉴定出几种不同的IBV血清型和基因型并且新变体仍然不断 出现。该些新变体之一是QX样IB。IB-QX已经呈循环性并自2004起在中国报道（Liu 和Kong，Avianpathology，33:321-327,2004)。被鉴定为QX的病毒优势地与多种形 式的肾病变相关。其他研究者还已经在中国报道了相似的毒株（Liu等人，JofGen Virol, 86:719-725, 2005)。在 2007 年，Cuiping等人（Vet.Microbio.，122:71，2007)证实 了Liu等人（2005)呈献的数据，所述数据报告在2003年和2005年之间从接种的鸡群和未 接种的鸡群分离肾型毒株。相似的研究结果也已经在俄罗斯和欧洲其他地区报道炬ochkov 等人，AvianPathology, 35:379-393, 2006 ;Landman等人，Proceedingsofthe14thWorld Veterinary化ultryCongress, 22-26August, 2005,Istanbul, "Turkey,第 369 页）。
[0015] 不太可能的是可在全部国家中使用一种通用检测法，因为在不同国家施用了不同 的IBV疫苗株。因此，需要开发一种实惠、易于执行并易于解释结果W区分传染性支气管炎 (IB)野生型和疫苗型的测定法。
[0016] 尽管采用密集接种计划，新城疫病毒（NDV)仍总是威胁全球商业养禽场。NDV是单 分子负链RNA病毒目（Mononegavirales)、副粘病毒科（Paramyxoviridae)和禽腮腺炎病毒 属（Avulavirus)的成员。它是一种包膜病毒，具有由15, 586个核巧酸组成的负义、不分节 段单链RNA基因组。其基因组由六个基因组成；核蛋白（NP)、磯蛋白（P)、基质蛋白（M)、融 合糖蛋白（巧、血凝素-神经氨酸酶化脚、糖蛋白和大聚合酶蛋白（L)。NDV中存在的六个 基因当中，其两种膜蛋白即F蛋白和HN蛋白在决定其毒力方面最重要。
[0017] 近年来实时PCR方法的建立已经导致多种传染介质的分子诊断学取得明显进展， 并且已经快速削减为现场兽医师和农民提供快速和精确结果的疾病诊断结果周转时间。已 经针对使用几种不同化qMan探针或SYBR绿进行NDV检测和基因型区分的实时PCR分析描 述了许多PCR测定法（Wise等人，J.ClinMicrobiol, 42:329-338, 2004)sTan等人（J.Virol Method, 160:149-156, 2009)描述了用于检测和区分NDV基因型的SYBR绿I实时PCR,然而 该种测定法需要不同引物对用于检测不同NDV基因型并且严重依赖分析烙解峰来区分S 个NDV基因型。尽管SYBR绿1测定法是与其他实时检测样式相比，建立实时PCR的成本最有 效和最容易形式，然而，主要缺点是染料分子结合于反应混合物中存在的任何双链DM(包 括非特异性PCR产物或引物-二聚体）。因此，存在改善当前分子诊断方法W提供快速和结 论性NDV检验结果的空间。
[001引发巧简巧
[0019] 本发明设及一种表征IBV、CSFV或NDV的方法或过程，所述方法或过程包括步骤： a)从病毒株产生cDNA;b)在实时聚合酶链反应（PCR)中使所述cDNA暴露于包含正向引物 和反向引物的引物对W产生扩增子，其中所述引物对是对病毒基因组的某个基因或区域特 异的；C)在实时PCR后立即对包含扩增子的双链产物进行高分辨烙解（HRM)曲线分析；和 d)分析并比较HRM曲线，从而表征病毒株。IBV的基因可W是S1基因。NDV的基因可W是 尸、^、口、]?、歴或1基因。〔5。￥的区域可^是四种结构性佑、61113、61和￡2)或8种非结构 性蛋白（化ro、P7、NS2、NS3、NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)区域。
[0020] 本发明还提供随该类方法使用的底物和试剂盒。
[00川 附图简巧
[0022] W下详细描述可W结合附图最好地理解，所述详细描述W举例方式给出，但不意 在将本发明唯一地限于所述的具体实施例，其中：
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