应用双重高分辨率熔解曲线技术检测巴尔通体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及己尔通体的分子生物学检测领域，具体地说，设及一种应用双重高分 辨率烙解曲线技术检测己尔通体的方法。
【背景技术】
[0002] 感染性屯、内膜炎（Infectiveendocarditis,I巧是一类严重威胁生命，临床表现 极其复杂且诊断十分困难的疾病。近年来，虽然预防和治疗水平有了很大提高，但发病率和 死亡率依然比较高。目前研究发现感染人类屯、内膜炎的己尔通体炬artonellaspp.)种类 越来越多，已报道有8种己尔通体，其中W汉赛己尔通体化henselae,Bh)和五日热己尔 通体化quintana，Bq)为主，该两种病原体均为革兰染色阴性、氧化酶阴性、营养条件要求 苛刻、兼性细胞内寄生的需氧杆菌，主要寄生在人、猫、狗和晒齿动物等血管内皮细胞和红 细胞内，通过跳圣和体風等吸血节肢动物传播，可引起人类猫抓病、战壞热、屯、内膜炎和杆 菌性血管瘤等多种疾病。除外化和Bq，有报道引起人和动物屯、内膜炎的还有B.vinsonii subsp.berkhoffii,B.vinsoniisubsp.arupensis,B.clarridgeiae,B.koehlerae和 B.alsatica。
[0003] 目前，对化和Bq检测方法主要是分离培养、血清学检测、常规PCR和实时巧光定 量PCR检测。己尔通体菌生长缓慢、营养条件要求苛刻且难于分离培养，一般应用膜酶大 豆琼脂培养基、哥伦比亚培养基或脑屯、浸液琼脂中加入5% -10%的兔血、羊血或马血（脱 纤维抗凝），在潮湿条件下，25°C-37C培养7-14d，甚至更长时间，菌落没有特征性，不能用 于菌种鉴定。血清学检测通常用IFA法和化ISA法检测抗体，化和Bq有市售的检测试剂 盒，该方法在判读结果时有一定的主观性，灵敏度和特异性均不高，不能很好地区分Bq和 Bh，且容易与衣原体等其他微生物出现交叉反应。常规PCR检测存在引物结合缺乏特异性， 实验室污染和临床样品中PCR抑制物存在造成假阴性等，在基因扩增后还需进一步琼脂糖 凝胶电泳测序来验证，相对耗时。实时巧光探针PCR方法依据序列特异性探针区别物种， 增加了特异性和灵敏度，但需要昂贵的探针，近年来在传染病病原检测上日渐普及，目前国 外报道通过扩增ssrA基因建立实时巧光探针PCR方法检测己尔通体属，国内也有报道采 用化qMan-MGB探针技术建立了检测化和Bq单重实时巧光定量PCR方法，但是一个PCR 体系只能检测一种或一类病原体，不能同时检测多种病原体。高分辨率烙解曲线分析技术 (化曲-resolutionmeltinganalysis,HRM)是在实时巧光定量PCR上发展的一种新技术， 克服了不饱和染料如SYBRGreen抑制PCR反应，解链过程中不会发生重排等缺点，使烙解 过程中发出的巧光信号具有更高的分辨率，国外已报道采用SYBR染料建立检测己尔通体 巧光定量PCR方法，最新报道有采用饱和染料cyto9扩增巧oB、gltA、ITS测序检测己尔通 体。但目前国内外尚无应用双重HRM技术同时检测化和Bq该两种病原体的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是基于双重高分辨率烙解曲线技术，提供一种检测己尔通体的方 法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供用于实时巧光定量PCR检测己尔通体的引 物组合，所述引物组合包括用于实时巧光定量PCR检测汉赛己尔通体化henselae,Bh)的 引物对I和用于实时巧光定量PCR检测五日热己尔通体化quintana，Bq)的引物对II。
[0006] 所述引物对I为；
[0007]BH14560-F ;5' -GAGTCAGATGGAATGGTATTGGTTATC-3'
[0008]BH14560-R ;5, -CGGTTTATCCCCCACAAGATAGG-3'
[000引所述引物对II为：
[0010]BQ11520-F ;5, -GGAACCAGTCCGCCAAAAG-3，
[0011] BQ11520-R ;5' -ATGGGTTGGTTTCTGCTGAGG-3'
[0012] 本发明还提供含有上述引物组合的用于实时巧光定量PCR检测己尔通体的试剂 盒。
[0013] 本发明进一步提供一种应用双重高分辨率烙解曲线技术检测己尔通体的方法，包 括W下步骤：
[0014] 1)提取样品中的DNA;
[0015] 2)W步骤1)中提取的DNA为模板，利用前述引物组合进行双重高分辨率烙解曲线 实时巧光定量PCR反应；
[0016] 3)分析实时巧光定量PCR产物。
[0017]其中，步骤 2)中采用的反应体系 20yL;MeltDoctor?HRMMasterKitlOuL，引 物对I和引物对II的上、下游引物（lOymol/L)各0. 6yL，DNA模板lyL，无核酸酶水补 足至总体积20UL。
[0018]扩增程序为；95°C3min;95°C15s，60°Clmin，40 个循环；
[0019] 烙解程序为；95°C30s，70°C30s，然后W〇. 2°C/s的速率升温至95°C，且每秒采集 一次巧光。
[0020] 本发明建立的双重实时高分辨率烙解曲线方法特异性强、灵敏度高、稳定性好。特 异性实验结果显示只有对应的己尔通体扩增出巧光信号，其他种属的细菌均未见巧光信 号，且汉赛己尔通体和五日热己尔通体的烙解温度（Meltingtemperature,Tm)值分别为 75. 60 + 0. 5°C和79. 80 + 0. 5°C;敏感性实验结果显示在20uL的反应体系中，双重实时高 分辨率烙解曲线方法检测汉赛己尔通体和五日热己尔通体最低检出限分别为3. 64X1〇1个 拷贝和5. 62X1〇1个拷贝，比常规PCR敏感性提高了 100倍，此外也显示出良好的线性关系 和扩增效率，相关系数R2分别为0. 998和0. 997,E值分别为102. 8%和104. 7%。重复性 实验结果显示组内和组间的CV值为0.22% -0.50%和0.50% -1.2%，在允许范围内。其 中汉赛己尔通体组内孔间CV值在0. 22% -0. 50%，组间重复测定CV值在0. 50% -0. 98%。 五日热己尔通体组内孔间CV值在0. 24% -0.45%，组间重复测定CV值在0. 50% -1. 20%。 采用本方法可同时快速检测出汉赛己尔通体和五日热己尔通体，为该两种己尔通体所引起 的屯、内膜炎等一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。
【附图说明】
[002。 图1为本发明实施例1中汉赛己尔通体（A)和五日热己尔通体做不同退火温度 的扩增曲线。
[002引图2为本发明实施例1中汉赛己尔通体（A)和五日热己尔通体做不同引物浓度 的扩增曲线。
[0023] 图3为本发明实施例1中五日热己尔通体不同烙解速率0.rC/s(A)、0.2°C/ s炬）、0. 4°C/s(C)、0. 6°C/s值）和 0. 8°C/s巧）的烙解曲线。
[0024] 图4为本发明实施例1中汉赛己尔通体（A)和五日热己尔通体炬）单重HRM实时 巧光定量PCR敏感性分析的扩增曲线和标准曲线。
[002引 图5为本发明实施例1中汉赛己尔通体（A)和五日热己尔通体做双重HRM实时 巧光定量PCR敏感性分析的扩增曲线和标准曲线。
[002引图6为本发明实施例1中汉赛己尔通体（A)和五日热