一种梨果实萼片状态主效qtl位点的snp分子标记引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种梨果实萼片状态主效QTL位点的SNP分子标记引物及其应用。一种与梨果实萼片状态主效QTL位点紧密连锁的SNP标记Pybd06_026，正向引物CALYX-F：SEQ?ID?NO.1，反向引物CALYX-R：SEQ?ID?NO.2。利用该特异引物基于高分辨率溶解曲线可对萼片状态进行良好分型，即检测QTL位点qCalyx上的多态性表达萼片状态的差异。本发明提供的梨果实萼片状态主效QTL分子标记引物可用于梨果实萼片状态的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
【专利说明】—种梨果实萼片状态主效QTL位点的SNP分子标记引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子遗传育种领域，提供了一种梨果实萼片状态主效QTL位点的SNP分子标记引物及其应用。
【背景技术】
[0002]我国是世界梨属(Pyrus L.)植物最主要的起源地之一，遗传多样性丰富。梨的栽培种分布广泛，除了海南省和台湾省，都有栽培。梨果实的营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。萼片是指花的最外一轮，构成花萼的各片，一般呈叶状，在花期有保护花蕾的作用。萼片通常在花朵开放后即脱落，但也有些梨果实的品种其萼片直至果实成熟依然存在，这种称为宿存萼。根据梨果实萼片是否宿存可将其分为宿萼果和脱萼果。据统计，‘砀山酥梨’、‘鸭梨’、‘雪花梨’、‘新高’、‘黄金’和‘库尔勒香梨’等品种，果实均有宿萼和脱萼的现象存在。萼片宿存不但影响果形美观，对于果实的内在品质也有不同程度的影响。萼片脱落的果实大多萼端凹陷，俗称“母梨”、“脱萼果”或“洼顶果”，其果形端正，属正形果，果实核小，石细胞少，糖分高水分足，风味好，经济价值高；而萼片宿存的果实大多萼端凸起，俗称“公梨”、“宿萼果、”或“突萼果”，其果皮粗糙，果核大，石细胞多，内含物含量低，品质低下，风味淡，果实成熟期推迟，商品价值大大降低。因此，果实萼片宿存与否是影响梨外观及内在品质的重要因素之一，也是新品种选育时的重要评价指标之一。
[0003]由于绝大多数梨品种是自交不亲和的，梨的遗传组成表现高度杂合性；同时，由于多年生果树的农艺性状多数表现为数量性状遗传特征，有关梨的重要性状遗传规律研究相对滞后，也难以开展目标性状的遗传改良。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座(QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状表型之间的关系，可直接确定控制数量性状位点，开发可应用于分子标记辅助选择育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。
[0004]目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对梨果实萼片状态的QTL定位及检测QTL位点上的多态性表达萼片状态差异的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展梨果实萼片状态的QTL定位，基于相应序列信息开发SNP分子标记，并建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果实品质，提高育种效率，节约生产成本显得尤为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是定位梨果实萼片状态主效QTL，根据贡献位点序列信息开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实萼片状态的SNP特异标记Pybd06_026，检测QTL位点qCalyx上的多态性表达萼片状态的差异。通过该分子标记可以预测梨果实萼片宿存与脱落状态，为实现果实萼片状态的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。
[0006]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0007]一种与梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx紧密连锁的SNP标记引物对，其中
[0008]正向引物CALYX-F5，-GCAATTTGTGTACATGCGTGC-3’ (SEQ ID N0.1)，
[0009]反向引物CALYX-R5’ -AATGTAGGCCTTGAACCACA-3’ (SEQ ID N0.2)；
[0010]该引物对用来检测登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold240.0的第291698个碱基处是否存在一个与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx，同时检测QTL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，该SNP位点位于第6连锁群的101.0cM处，其解释了遗传变异的16.7%，LOD值为2.65。
[0011]本发明所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用，利用所述的引物对基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold240.0的第291698个碱基处是否存在一个与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx，同时检测QTL位点上的多态性表达萼片状态的差异，预测梨果实萼片宿存与脱落状态，以实现果实萼片状态的早期鉴定和筛选。
[0012]本发明所述的SNP标记引物对在检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx及其SNP多态性中的应用。 [0013]本发明所述的引物用于检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx的SNP标记方法，利用本发明所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在332bp，表明存在所述的QTL位点qCalyx ;PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCycler* 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片脱落的品种和表达果实萼片宿存的品种为对照，检测QTL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx上的多态性表达的萼片状态和对照相似。
[0014]其中所述的已知具有与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx上表达萼片宿存的品种优选‘砀山酥梨’，表达果萼脱落的品种优选‘八月红’。
[0015]所述的HRM 反应的反应体系优选按照LightCycler.480High Resolut1n MeltingMaster试剂盒中的说明书进行，1yL反应体系:含有2ng.μ L—1梨基因组DNA模板、I XMaster Mix、2.0mmol.L-1MgCl2、0.2mmol.L-1权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR:95°C预变性lOmin，然后95°C变性1s,60~55°C，每循环下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环；
[0016]PCR循环结束后进行熔解的程序优选为:95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
[0017]一种与梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx紧密连锁的SNP标记，该分子标记由引物对:正向引物CALYX-F SEQ ID N0.1和反向引物SEQ ID N0.2扩增梨基因组DNA得到。
[0018]本发明所述的SNP标记在梨分子育种中的应用，该分子标记位于梨的6号连锁群上的101.0cM处，K值为11.831，在α = 0.005显著水平下显著；同时，利用区间作图法，鉴定得到该标记的LOD值为2.65，解释16.7%的变异。
[0019]本发明所述的SNP标记在检测梨果实萼片状态主效QTL位点及其SNP多态性中的应用。
[0020]本发明所述的SNP标记用于检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx的SNP标记方法，其特征在于:利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在332bp，表明存在所述的QTL位点qCalyx ;PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCycler4 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片脱落的品种和表达果实萼片宿存的品种为对照，检测QTL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx上的多态性表达的萼片状态和对照相似；其中，所述的已知具有与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx上表达的果萼宿存的品种为‘砀山酥梨’，表达的果萼脱落的品种为‘八月红’。
[0021]有益效果
[0022](I)本发明首次对决定‘八月红’和‘砀山酥梨’果实萼片状态的数量性状位点进行了 QTL定位，定位的QTL位点对该数量性状的存在显著关联关系(α = 0.005)，且贡献率较高，位点的贡献率为16.7%。这为实现分子辅助育种多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提。
[0023](2)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需(5cM，本发明中果实萼片状态主效QTLqCalyx定位直接定位到SNP标记上，且Kruskal-Wallis统计测验值为11.831，在α = 0.005显著水平下显著，区间作图检测到LOD值为2.65，连锁性和可靠性高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重
要意义。
[0024](3)本发明根据定位的梨果实萼片状态性状主效QTL位点qCalyx开发检测梨果实萼片状态的SNP标记Pybd06_026引物，用于预测QTL位点qCalyx上多态性表达果实萼片状态差异，为梨果实萼片状态的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
[0025](4)利用开发的SNP标记引物，对‘八月红’和‘砀山酥梨’ 24株杂交群体进行QTL位点qCalyx上多态性表达果实萼片状态差异基因型检测，可将杂交群体分为两组，与果实实际观察的萼片脱落和萼片宿存相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对后代果实萼片状态进行良好分型(图2)，因此，具有良好的应用价值，可实现对梨果实萼片状态的预先选择和辅助育种。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为梨果实萼片状态主效QTL区间及SNP标记位点Pybd06_026在第6连锁群上的位置。LG6代表的是‘八月红’和‘砀山酥梨’合并遗传连锁图谱的第6连锁群。SNP标记名称起始为‘Pyb’的代表来自‘八月红’的SNP标记，起始名称为‘Pyd’的代表来自‘砀山酥梨’的SNP标记，起始名称为‘Pybd’的代表同时来自‘八月红’和‘砀山酥梨’的SNP
T 己 O
[0027]连锁群左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为CM。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间。右边的曲线图为QTL的LOD分布图。果实萼片状态QTL位点对应连锁群上的Pybd06_026标记，其位于第6连锁群101.0cM处，LOD值为2.65。
[0028]图2为依据SNP标记Pybd06_026开发的HRM特异标记引物，在‘八月红’和‘杨山酥梨’后代24个个体中检测的归一化平移溶解曲线，可良好分型。熔解曲线:线型I一红色曲线，7株个体，其中5株为萼片脱落；线型2—蓝色曲线，17株个体，其中16株为萼片宿存。两组的符合率分别为71%和94%。
【具体实施方式】
[0029]实施例1:
[0030]梨果实萼片状态主效QTL连锁的分子标记，是通过以下方法获得的:
[0031]a)利用‘八月红’和‘砀山酥梨’(品种为公知公用，见文献:张瑞萍等，梨AFLP标记遗传图谱构建及果实相关性状的QTL定位，园艺学报，2011，38 (10):1991 - 1998)杂交获得其102株F1后代单株。
[0032]b)利用RADseq方法高通量测序，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型，利用X 2测验分析各标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔遗传分离比例。 [0033]c)用Joinmap4.0分析软件构建‘八月红’和‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适于CP群体构图的格式导入Joinmap4.0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，卡方检测的P值为0.05，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图。
[0034]d)对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其F1群体单株的果实萼片状态进行观察记录，萼片完整存在的记录为果萼宿存，萼片不存在或缺损，且存在萼片脱落痕迹的，记录为果萼脱落。
[0035]e)将果实萼片状态的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL5.0软件，选择区间作图法，以LOD值> 3.0为标准，对梨的果实萼片状态进行QTL分析和定位。结果表明，在‘八月红’和‘砀山酥梨’的第6连锁群上检测到果实萼片状态的主效QTL位点qCalyx (图1)，对该性状的贡献率为16.7%，其对应的SNP标记Pybd06_026在连锁群上的遗传距离为101.0cM, LOD 值为 2.65。
[0036]f)利用SNP标记位点Pybd06_026开发HRM特异引物。
[0037]通过梨全基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/),从登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold240.0中搜索出第6连锁群上SNP标记Pybd06_026的DNA序列，选取的该位点前后300bp的序列，依据引物设计原则，开发设计SNP标记引物。正向引物序列 CALYX-F 为 ‘ 5-GCAATTTGTGTACATGCGTGC-3，;反向引物 CALYX-R 为‘5-AATGTAGGCCTTGAACCACA-3’。扩增产物序列大小332bp，利用设计的SNP标记引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小；即均能够扩增到332bp左右的片段。因此，该引物可作为梨果实萼片状态性状的检测标记。
[0038]g)利用HRM技术对梨果实萼片状态进行分型。
[0039]HRM 反应体系按照LightCycler" 480High Resolut1n Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480II突光定量PCR仪上进行。
[0040]10 μ L反应体系:含有2ng.μ l-1梨基因组DNA模板，I XMaster Mix,
2.0mmol.L^1MgCl270.2mmol.L—1权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C 预变性 lOmin，然后 95°C 变性 10s、60 ~55 °C (每循环下降
0.50C )退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环。
[0041]PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95°C Imiη, 40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
[0042]最后，在LightCycler*480II 的 Gene Scanning 软件中 1.5vers1n 自动生成扩增产物的熔解曲线
[0043]利用g)步骤中得到的SNP标记引物对‘八月红’ X ‘砀山酥梨’的24个杂交后代群体进行HRM分析(图2)。
[0044]线型I一红色曲线，7个体线型相似，其中5个体为果萼脱落；
[0045]线型2—蓝色曲线，17个体线型相似，其中16个体为果萼宿存。
[0046]统计分析表明，24个个体分型为两种基因型，分离比例为7:17。根据QTL位点qCalyx上多态性表达果实萼片状态差异基因分型结果将24个个体的果萼状态表型数据进行卡方检验(P = 0.000 7)，测验结果显示果萼状态基因型有关，且两组的符合率分别为71%和94%。因此，通过对果萼状态性状的表型测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明该特异SNP标记可检测Q TL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，对梨果实萼片状态良好分型。
【权利要求】
1.一种与梨果实萼片状态主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于:
正向引物 CALYX-F:SEQ ID N0.1，
反向引物 CALYX-R:SEQ ID N0.2。
2.权利要求1所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用，其特征在于利用所述的引物对基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSUOOOOOOOO的梨基因组序列scaffold240.0的第291698个碱基处是否存在一个与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx,同时检测QTL位点上的多态性表达萼片状态的差异，预测梨果实萼片宿存与脱落状态，以实现果实萼片状态的早期鉴定和筛选。
3.权利要求1所述的SNP标记引物对在检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx及其SNP多态性中的应用。
4.权利要求1所述的引物用于检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx的SNP标记方法，其特征在于:利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在332bp，表明存在所述的QTL位点qCalyx ；PCR循环结束后进行熔解，最后，在LightCycler? 480II的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片脱落的品种和表达果实萼片宿存的品种为对照，检测QTL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx上的多态性表达的萼片状态和对照相似。
5.根据权利要求4所述的SNP标记方法,其特征在于已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片宿存的品种为‘杨山 酥梨’，已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片脱落的品种为‘八月红，。
6.根据权利要求5所述的SNP标记方法，其特征在于所述的HRM反应的反应体系按照LightCycler* 480High Resolut1n Melting Master 试剂盒中的说明书进行，10 μ L 反应体系:含有 2ng.μ L 1 梨基因组 DNA 模板、I XMaster Mix、2.0mmol.L 1MgCl2^0.2mmol.L 1 权利要求I所述的引物； 扩增程序采用降落式PCR:95°C预变性lOmin，然后95°C变性10s、60~55°C，每循环下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序进行45个循环； PCR循环结束后进行熔解的程序为:95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光I次，最后降温至40°C。
7.一种与梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx紧密连锁的SNP标记，其特征在于该分子标记由引物对:正向引物CALYX-F: SEQ ID N0.1和反向引物CALYX-R: SEQ ID N0.2扩增梨基因组DNA得到。
8.权利要求7所述的SNP标记在梨分子育种中的应用，其特征在于该分子标记位于梨的6号连锁群上的101.0cM处，K值为11.831，在α = 0.005显著水平下显著；同时，利用区间作图法，鉴定得到该标记的LOD值为2.65，解释16.7%的变异。
9.权利要求7所述的SNP标记在检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx及其SNP多态性中的应用。
10.权利要求7所述的SNP标记用于检测梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx的SNP标记方法，其特征在于:利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应，如果扩增产物序列大小在332bp，表明存在所述的QTL位点qCalyx ;PCR循环结束后进行熔解，最后，在1」81^(^(；160 48011的Gene Scanning软件中1.5vers1n自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知QTL位点qCalyx上表达果实萼片脱落的品种和表达果实萼片宿存的品种为对照，检测QTL位点qCalyx上的多态性表达果实萼片状态的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实萼片状态主效QTL位点qCalyx上的多态性表达 的萼片状态和对照相似；其中，所述的已知具有与梨果实萼片状态相关的QTL位点qCalyx上表达的果萼宿存的品种为‘砀山酥梨’，表达的果萼脱落的品种为‘八月红’。
【文档编号】C12N15/11GK104032022SQ201410274731
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】吴俊 , 张绍铃, 李雷廷, 齐笑笑, 刘伦, 张明月, 谢智华 申请人:南京农业大学