，优选qPCR进行熔解曲线分析前被 扩增。自1980年以来，PCR已被用于在数个数量级扩增核酸分子，例如DNA和RNA (例如参见 US4683202)。定量实时PCR(qPCR)是在其中荧光染料被用于在每个PCR循环后，检测PCR产物 的量的方法(例如参见US5994056)。实时qPCR是用于基因表达分析的一种非常有效的工具。 它是用于样品中的低丰度mRNA的检测和定量的最灵敏的方法。qPCR的已知应用包括例如验 证微阵列结果，单细胞qRT-PCR，包括基因分型的诊断以及病毒、细菌和寄生虫的检测。RNA 分子使用逆转录PCR(rtPCR)被扩增。定量逆转录PCR(qRT-PCR)在用于试验的起始材料是 RNA时被使用。
[0043] 熔解曲线分析（熔解曲线分析）是加热过程中双链核酸分子的解离特性的评估 (US5871908，US6174670)。随着温度升高，双链开始解离，导致吸收强度的上升。熔解温度 (T m)通常由仪器软件从熔解曲线数据通过绘制对温度的负一阶导数(-dF/dT)计算。该导数 熔解峰是熔解温度的最高点。DNA片段的T m依赖于它的长度、G+C组成、序列、链互补性、浓度 和缓冲区成分，诸如盐、染料和PCR增强剂。
[0044] 高分辨率熔解(HRM)分析使得能基于其序列、长度、G+C含量、和链互补性的微小差 异分析核酸样品。它已被用于一些强大的应用，包括突变发现(基因扫描），杂合性缺失筛 查，DNA指纹识别，SNP基因分型，单倍型区段的表征，DNA甲基化分析，DNA映射，物种鉴定，体 细胞获得突变率，HLA兼容性分型，关联(病例/控制)研究，等位基因在种群中的流行和候选 易感基因的鉴定。
[0045]荧光基团在一个波长吸收光能量，并且作为响应，在另一较长波长重新发射光能 量。每个荧光基团均具有吸收光的不同波长范围，和发射光的另一不同波长范围。此属性使 它们能通过实时PCR仪器和通过其它分析工具和/或分析技术用于PCR产品的特异性检测。 [0046]术语淬灭描述给定荧光基团处理的量子产量的降低，其导致所发射的光的强度降 低。猝灭剂是这样的分子，其可以从荧光基团接受能量，然后消散它，而不必与供体荧光基 团发射相同范围的光(光发射）。这两个分子之间的能量传递被称为FRET(荧光共振能量转 移）。当猝灭剂从极为接近其相应的荧光基团分子被移除，荧光基团分子可以再次释放其额 外的能量作为在其特征波长的荧光。FRET荧光基团对的一些例子是FAM-TAMRA和VIC-TAMRA〇
[0047] 存在两种基本功能类型的荧光基团。第一类型的荧光基团具有结合到双链核酸分 子中的能力。SYBR Green I是这种类型的已知荧光基团的一个例子。它是对于qPRC应用最 常用的荧光基团。这种类型的其它合适的荧光基团包括溴化乙锭、BEB0、B0XT0、LC Green， SYT09和Eva Green。
[0048] 第二类型的荧光基团可被用作附着于短核酸链的标记或标签，通常引物或探针。 这种类型的荧光基团的例子包括FAM、HEX、NED和TAMRA。一些这种类型的荧光基团可被用作 淬灭剂分子。已知猝灭剂分子包括其它焚光基团，其从主焚光基团获取能量并在不同波长 发射，和猝灭剂，其不发射可见光如黑洞猝灭剂(BHQ)产品系列。
[0049]用于qPCR和熔解曲线分析的检测化学物质可分为两个基本组：非特异性化学物 质，其通常检测靶结合染料，如DNA结合染料的荧光，和靶特定化学物质，其通常利用荧光探 针和/或引物。在下文中，DNA被用作靶(或核酸分子)的一个例子，但讨论同样也适用于其它 类型的靶(或核酸分子）。
[0050]几种类型的特异性检测化学物质可商购。它们利用被专门设计用于检测靶DNA序 列的标记寡核苷酸探针。荧光标记或标签是优选的。水解探针是最常用的qPCR探针（如 TaqMan探针），但它们不适于在熔解曲线分析中使用。其它靶特异性检测化学物质，也可以 适用于熔解曲线分析，包括发夹探针(其中的分子信标探针是最流行的），LightUp(照亮)探 针和杂交探针(也称为FRET探针），其包括MGB克制杂交探针(Solaris，Pleiades)。
[0051 ]熔解曲线分析的最简单、成本最低的方法，使用DNA结合荧光基团或用于靶DNA序 列的非特异性检测的其它报告分子。这作为标准引物执行起来既快速又经济，并且可以使 用非特异性染料。使用非特异性检测化学物质，试验的灵敏度和特异性仅由PCR引物来确 定。
[0052]通常，PCR仪器被设置为在PCR扩增后，通过逐渐增加温度和监测作为温度函数的 荧光进行熔解曲线分析。作为另一实例，熔解曲线分析可以在PCR扩增完成之后，通过独立 于PCR仪器的仪器或设备进行。当温度高到足以使双链DNA变性时，荧光发生急剧下降，并且 焚光基团分子被释放。
[0053]基本熔解曲线分析通常用于检查PCR反应的特异性。数据通常例如以0.5°C的温度 增量被收集。由于较低的分辨率要求，基本熔解曲线分析可以在非饱和荧光基团条件下例 如使用SYBRGr een进行。
[0054]在HRM实验中，数据通常以0.2°C和更小的温度增量被收集。以染料为基础的HRM分 析利用DNA结合荧光基团，其可以在饱和条件下被使用，而不抑制DNA聚合酶，例如LC Green 和Eva Green。饱和浓度防止熔解期间染料分子再分配，并提供更好的分辨率。基于探针的 熔解的不同之处只在于，通常，PCR扩增步骤是不对称的，这意味着其中一条链被设计为比 另一条链更有效地扩增。
[0055] 也可以添加非特异性染料(例如Β0ΧΤ0，ΒΕΒ0)到基于探针的qPCR反应中，如例如在 文章"恪角军Combining sequence-specific probes and DNA binding dyes in real-time PCR for specific nucleic acid quantification and melting curve analysis'，， Kristina Lind，Anders Stahlberg ,Neven Zoric，和Mikael Kubista，BioTechniques: 40:315-319，2006年3月。所获得的优点是使用熔解分析检查qPCR反应的特异性的能力，而 不必在qPCR阶段之后单独添加染料。这减少了污染的风险。
[0056] 本发明的实施例使得能够考虑到从第一熔解区域解离的荧光基团的重定位，从而 例如在非饱和条件下能够进行HRM分析。
[0057] 虽然术语种群在本文中主要用于指一组相似的核酸分子或核酸序列，例如，指一 组扩增的DNA或RNA序列，该术语也可以用于指一组其它种类的类似分子。作为术语的用法 的另一个例子，一组相似类型的焚光基团分子可以被称为(单个)种群焚光基团，例如相似 类型的所有荧光基团。作为进一步的例子，荧光基团可以按照它的结合状态被分配为单独 的种群，例如结合到核酸分子的第一种群的荧光基团可以构成荧光基团的第一种群(或第 一子群），结合到核酸分子的第二种群的荧光基团可以被视为构成荧光基团的第二种群(或 第二子群），而未结合荧光基团可被认为是荧光基团的第三种群(或第三子群）。（在这方面， 请参阅下文中荧光基团和它们的结合状态的更详细描述）。
[0058] 图1示出了示例性熔解曲线110。熔解曲线，例如熔解曲线110,是在所感兴趣的温 度范围内在研究中的溶液中的一种或多种核酸分子种群的恪解行为的描述，其中术语种群 是指一组相似的核酸分子。换言之，熔解曲线110描述了溶液作为整体的熔解行为。这种核 酸分子例如可以是由PCR过程产生的DNA革E1序列，如前文所述。核酸分子的进一步例子包括 由其它方法扩增的片段，所述其它方法包括等温扩增，例如从限制性内切酶消化所得的提 取片段和例如从免疫沉淀得到的沉淀片段。
[0059]所研究的溶液中所包括的一个或多个核酸分子种群的每一个均显示出熔解行为， 即其类型和序列的特征。如果溶液包含两个或多个不同序列的核酸分子种群，熔解曲线是 两个或多个核酸分子种群的共同熔解行为的指示，并且在不借助于复杂的分析技术的情况 下，它通常不可能提取特定于任何单个核酸分子种群的熔解曲线。如果溶液包含核酸分子 的单个种群，熔解曲线110可以直接指示单个核酸分子种群的熔解行为。然而，取决于作为 熔解曲线110推导基础应用的其它类型荧光基团或报告分子的特性，描述作为整体的溶液 的熔解行为的熔解曲线110,与特定于包含在溶液中的单个核酸分子种群的熔解曲线之间 的关系在某种程度上可能更复杂。因此，进一步的分析可能被需要，以基于整体熔解曲线 110提取单个核酸分子种群的熔解行为。
[0060] 下文中，为了描述的简洁和清楚，荧光基团分子被简称为荧光基团。在感兴趣的溶 液中的荧光基团可以是未结合于溶液的任何核酸分子的自由荧光基团，即未结合荧光基 团。可替代地，荧光基团可以结合到溶液中的核酸分子中的一个。由荧光基团发射的光通常 取决于其至溶液中的核酸分子的一个的结合，即取决于荧光基团的结合状态。作为一个例 子，未结合双链DNA结合荧光基团以第一光强度发射光，而当它们被结合到双链核酸分子的 种群时，它们以第二光强度发射光，其中第一光强度显著低于第二光强度。第二光强度依赖 于核酸分子中双链区域的量，从而提供了依赖于供相应的荧光基团结合的核酸分子的序 列，其在熔解或再退火过程中可检测。用作本文中的示例的第一和第二光强度和/或由荧光 基团发射的光的波长依赖于所用的荧光基团的特性。第一和第二光强度可以进一步依赖于 环境因素，例如周围溶液的化学组成。
[0061] 熔解曲线110的例子是由感兴趣的溶液发射的光强度的荧光信号描述，其是温度 的函数。适合于表示熔解曲线数据以及因此表示熔解曲线110的荧光信号，熔解可以通过为 所研究的溶液提供已知数量、已知浓度和/或已知体积的特定类型荧光基团分子，并将溶液 的温度从起始温度提高到最终温度，而在同一时间使用第一波长的光激发溶液-特别是其 中的荧光基团，所述第一波长是所使用的荧光基团分子的类型的特征。其结果是，荧光基团 分子以第二波长发射光，所述第二波长是所采用的荧光基团分子的特征。因此，由溶液发射 的光构成荧光信号，所述荧光信号因此是熔解曲线数据的描述。
[0062] 虽然由荧光基团种群发射的光的强度可以是恒定的或基本上恒定，而与温度无 关，通常由荧光基团种群发射的光的强度进一步依赖于温度(并且因而依赖于核酸的解离 状态），例如使得荧光基团种群的有效发射效率随着温度的升高而降低。升高温度意味着溶 液的分子表现出更多的运动，并且因此分子之间碰撞的概率增加。进入激发态的焚光基团 通常导致荧光基团以其波长特性发射光，但碰撞可以通过声子的相互作用提供从激发态的 替代松弛路径，由此导致尽管激发态，荧光基团也不能发光。因此，对于某些荧光基团种群， 增加温度意味着降低发射效率。
[0063] 作为这方面的一个例子，发射效率ru,tot可以表现出随着温度的升高呈指数衰减， 例如根据按照公式(1)的参数函数。
[0064]
( 1 )
[0065]其中参数Hi表示给定荧光基团种群的基准发射效率，T表示温度，并且参数^表示 由于分子间的碰撞，对于给定荧光基团种群的发射效率衰减系数。作为非限制性示例，参数 ^的值可以在从5至5001/°C的范围内。下标i=0的情况下参数表示用于未结合荧光基团种 群的公式（1)的相应参数，而在下标i>0的情况下参数表示用于结合到所感兴趣的溶液中的 核酸分子种群中的一个的荧光基团的公式（1)的相应参数。基准发射效率的值m用于指示 未结合荧光基团种群相较于溶液中的其它荧光基团，即相较于结合到核酸分子种群中的一 个的分子的荧光基团种群的相对发射效率，并且因而它们的绝对值，对于根据公式(1)的发 射效率模型的适用性，通常不是至关重要的。然而，如果这样的信息是可获得的，对于给定 类型的荧光基团和/或对于给定的核酸分子种群，能够使用先验已知的参考值。代替将发射 效率建模为随温度升高的单调指数衰减，衰减可替代地可以例如通过表现出随温度升高单 调减少的线性函数或分段线性函数来建模。按照公式（1)在给定温度下发射效率ru,tot的温 度描述函数的一个例子是由图2中的实线曲线提供的。
[0066] 虽然发射效率随着温度升高的单调衰减可以被认为是几种类型的荧光基团的特