用于使用代谢工程化丙酸杆菌产生正丙醇和丙酸的方法
【专利说明】
[0001 ]本申请案要求2012年12月21日提交的美国临时专利申请案61/740,490的优先权， 所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
[0002] 本发明涉及代谢工程化细菌，以及其制备和其在一种用于将生物基底物生物转化 成含有正丙醇、丙酸或其组合的产物的方法中的用途。
【背景技术】
[0003] 对化石燃料的未来稀缺、成本和环境影响的顾虑已经激起人们对开采廉价、可再 生生物质作为燃料和化学品的替代来源的关注。由于原油价格已经上涨，生物基化学品和 工业产品已经变为来源于石油的对应物的有吸引力的替代方案。使用厌氧微生物的发酵方 法提供用于将生物质和农业废物转化成化学品和燃料的有前景的途径。存在大量的需要适 当处置以避免污染问题的低值农业商品和食品加工副产品/废物。这些生物质废物材料可 以用作生产燃料和化学品（例如有机酸和醇）的低成本原料。通过发酵途径衍生的产物尤其 为正丙醇和丙酸。
[0004] 正丙醇（1-丙醇、伯丙醇、丙-1-醇）为可与水和其它常用溶剂自由混溶的无害溶 剂，其在工业中有大量应用。这些应用包括例如印刷墨、涂料、清洁剂、粘合剂、除草剂、杀昆 虫剂、药物、除冰流体，以及作为用于生产酯、丙胺、卤化物和热塑性树脂的中间物。还已经 提出了在燃料掺合物中使用正丙醇，因为这种醇具有与乙醇相同的用于增加辛烷值以及充 当汽油中的抗爆添加剂的能力。
[0005] 举例来说，丙酸是广泛用于生产纤维素塑料、除草剂以及香料的重要化学品。丙酸 也是重要的防霉剂。其氨盐、钙盐、钠盐以及钾盐广泛用作食品和饲料防腐剂。某些其它羧 酸也具有工业价值，例如琥珀酸，其能够氢解以产生丁二醇，所述丁二醇适用于生产聚酯和 热成型树脂。
[0006] 虽然正丙醇与丙酸两者都可以通过发酵方法产生，但许多常规发酵方法具有生产 率(productivity)、产率(yield)以及最终产物浓度和纯度低的问题，并且其对于商业应用 而言是不经济的。目前，大部分商业出售的丙酸通过石油化学方法产生。然而，人们对通过 丙酸杆菌由糖的发酵来产生丙酸的关注已经逐渐增加。尽管通过各种方法和菌株改良来提 升发酵生产率和最终产物浓度已经取得一些成功，但在发酵方法中如何进一步提升丙酸产 率和纯度仍然是一个难题。开发用于化学生产的经济上可行的发酵方法需要不仅具有高生 产率并且可以容许高浓度的发酵产物的微生物。
[0007] 用于改良工业微生物的方法在经典菌株改良（CSI)的随机方法到代谢工程的极合 理方法范围内。尽管CSI是众所周知并且常用的方法，但其就时间与资源两者而言都是密集 型的。为了获得对抑制性发酵产物具有高耐受性的菌株，通过在培养基中用逐渐增加的抑 制剂浓度连续培养来连续筛选和选择突变体通常与通过化学诱变剂或紫外线(UV)辐射来 诱发诱变结合使用。然而，常规的培养物筛选过程是冗长、耗时的并且通常是徒劳的。最近， 还已经对重组DNA技术加以应用来提升对抑制性产品的细胞耐受性。这些方法通常更有效， 但使用起来也更复杂，并且需要了解在基因水平上的详细抑制机制，这对于受到特别工业 关注的多数微生物而言是无法获得的。
[0008] 代谢工程广泛用于设计工程化菌株以通过改变代谢流量分布来实现代谢过度生 产的较高效率。迄今为止的大部分代谢工程研究与使用生物来产生次级代谢物(例如抗生 素）、氨基酸(例如赖氨酸）以及异源蛋白质有关，所述生物具有经充分研究的遗传学和生理 学(例如，大肠杆菌(E.coli)、酵母以及杂交瘤细胞）。对代谢流量分布的化学计量分析为代 谢工程、最佳培养基调配和喂养策略以及生物过程最佳化提供指导，然而其需要对发酵细 胞中的代谢和调节网络的深入了解。尽管合理代谢工程方法已经在涉及单个基因或一个基 因簇内的一些基因的情况下取得成功，但其在涉及复杂或在很大程度上未知的代谢途径的 许多情况下是无效的。这是因为合理代谢工程方法通常一次靶向一个基因，并且因此不能 预测途径中的多个基因之间的复杂相互作用。
[0009] 丙酸杆菌是革兰氏阳性(Gram-positive)、过氧化氢酶阳性、无芽孢形成、不动、兼 性厌氧的杆状细菌。丙酸杆菌属(Propionibacterium)的成员（以复数形式或以在这个属内 的任何单个但未鉴别的物种的形式，统称为"丙酸杆菌（p r 〇 p i ο n i b a c t e r i a或a propionibacteria)"广泛用于产生维生素 B12、四吡略化合物和丙酸，以及用于益生菌和乳 酪工业。如图1所示，丙酸杆菌通过二羧酸途径产生丙酸，其中产生乙酸盐和琥珀酸盐作为 副产物。理论上，当糖酵解是通过恩伯登-梅耶霍夫-帕纳斯(Embden-Meyerhof-Parnas， EMP)途径时，一摩尔(mol)葡萄糖仅产生4/3mol丙酸盐和2/3mol醋酸盐。当存在显著细胞生 长和生物质形成时，实际丙酸盐产率低得多。即使在10克每升(g/L)的相对低浓度下，丙酸 盐也是对发酵的强抑制剂。典型分批丙酸发酵需要大致3天以达到20g/L丙酸，其丙酸产率 通常小于0.5克每克(g/g)葡萄糖。丙酸杆菌广泛用于工业中，并且已经对其中的若干种的 基因组进行完全测序。参见例如帕里奇（Parizzi)等人，"丙酸丙酸杆菌（Propioni-bacterium acidipropionici)的基因组序列对其生物技术和工业潜能提供深入了解(The genome sequence of Propioni-bacterium acidipropionici provides insights into its biotechnological and industrial potential)，"《BMC基因组学》(BMC Genomics)， 第 13 卷，2012,562-602。
[0010] 尽管迄今为止丙酸杆菌已经受到关注，然而，几乎没有研究针对这些细菌的遗传 工程，这是由于其基因组中的高GC含量、转化革兰氏阳性细菌的困难以及克隆工具的缺乏。 迄今为止，仅已基于最初从丙酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)中分离的质粒开发了两个 表达载体（其使用两个不同的启动子）pKHEM01和pKHEM04(参见例如库亚特帕潘 (Kiatpapan)等人，"构建用于丙酸杆菌的表达载体以及其在通过费氏丙酸杆菌 (Propionibacterium freudenreichii)产生5_氨基乙酰丙酸中的用途（Construction of an expression vector for propionibacteria and its use in production of 5_ aminolevulinic acid by Propionibacterium freudenreichii)，"〈〈应用微生物生物技 术》(Appl .Microbiol .Biotechnol.)，第56卷，2001，144-149)，以及两个报导子载体(其不 具有启动子)ρ?)210(法页(Faye)等人，"构建用于费氏丙酸杆菌中的启动子活性的活体内 分析的报导子向量系统（Construction of a reporter vector system for in vivo analysis of promoter activity in Propionibacterium freudenreichii)，'，《应用和环 境微生物学》(Appl .and Enviro.Microbiology)，第74卷，第 11 期，2008,3615_3617) ;pCVEl (皮奥(Piao)等人，"来自费氏丙酸杆菌的启动子元件的分子分析(Molecular analysis of promoter elements from Propionibacterium freudenreichii)，"《生物科学与生物工程 学杂志》(J.Biosci.and Bioeng)，第97卷，第5期，2004,310-316)。这一领域中的大部分发 表的研究旨在提升维生素 B12产量(参见例如库亚特帕潘等人，如上所引用;室冈(Murooka) 等人，"使用费氏丙酸杆菌的遗传工程产生四吡咯化合物和维生素 B12.概述(Production of tetrapyrro1e compounds and vitamin B 12using genetic engineering of Propionibacterium freudenreichii .An overview)，"《莱特》(Lait)，第85卷，第 1 到2期， 2005,9-22;并且仅有一篇论文已关注通过敲除丙酸丙酸杆菌ATCC4875中的乙酸激酶(ack) 基因来提升丙酸产量(苏瓦纳卡姆（Suwannakham)等人，"构建和表征丙酸丙酸杆菌的基因 敲除突变体用于增强的丙酸发酵(Construction and characterization of knock-out mutants of Propionibacterium acidipropionici for enhanced propionic acid fermentation)，"《威立国际科学》（Wiley InterScience) (www. interscience .wiley · com)，2006年2月28日；另外参见帕里奇等人，如上所引用）。 [0011]已经显示双功能醛/醇脱氢酶能够将乙酰-CoA和丁酰-CoA分别转化成乙醇和丁醇 (参见例如纳尔(Nair)等人，"来自丙酮丁醇梭菌(Clostridium ac