使用含有可通过丙酸盐诱导的ilvbn操纵子的重组棒杆菌生产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异 ...的制作方法
【专利说明】使用含有可通过丙酸盐诱导的M vbn操纵子的重组棒杆菌生 产L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、α-酮异戊酸、α-酮-β-甲 基戊酸或α-酮异己酸的方法
[0001] 本发明涉及一种使用微生物生产氨基酸及酮酸的方法，其中通过丙酸盐可诱导的 启动子使得某些基因可以受调节的表达。 现有技术
[0002] 氨基酸和酮酸用于人体医药、制药工业、化妆品、食品工业和动物营养。
[0003]许多这些化合物是通过棒状细菌菌株特别是谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)发酵产生的。由于其重要性，改良生产方法的研究在持续进行。方法改良可包 括发酵技术措施例如搅拌或氧供给，或者营养培养基的成分，例如在发酵期间的糖浓度，或 者产物形式的加工，例如离子交换层析，或者微生物自身的固有生产特征。
[0004] 为了改良这些微生物的生产特征，使用诱变、选择和突变体选择的方法。以此方 式，获得对于抗代谢物例如缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸或者亮氨酸类似物4-氮亮氨酸或者 5，5，5-三氟亮氨酸有抗性的菌株，所述菌株产生化学化合物，例如L-氨基酸L-缬氨酸或者 L-亮氨酸。
[0005] 一些年来，重组DNA技术的方法已经同样用于L-氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌的 菌株改良，例如增加或弱化各个氨基酸生物合成基因，例如在生产过程中也进行基因表达 的时序调节，以及研究对于化学化合物生产的影响。
[0006] 谷氨酸棒杆菌的生物学、遗传学和生物技术的概述见于"Handbook of Corynebacterium glutamicum"（Eds·:L·Eggeling and M.Bott,CRC Press ,Taylor& Francis，2005)、Journal of Biotechnology(Chief Editor:A.Piihler)特别出版的题目为 "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology"（Journal of Biotechnology 104/1-3,（2003))的出版物以及T.Scheper所著（Managing Editor) "Microbial Production of L-Amino Acids"（Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79，Springer Verlag,Berlin,Germany,2003)〇
[0007] 谷氛酸棒杆菌基因组的核昔酸序列在Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99_109(2003))、ΕΡ1108790和Kalinowski et al.(Journal of Biotechnology 104/1-3，（2003))中描述。
[0008] 谷氨酸棒杆菌基因组的核苷酸序列同样可以从美国国家医学图书馆的国家生物 技术信息中心（NCBI)数据库（86也68(^，]\?)，1]54)、日本0嫩数据库（008几]^811丨11^，如口311)或 者欧洲分子生物学实验室的核苷酸序列数据库(EMBL, Heidelberg, Germany和Cambridge, UK)获得。
[0009] 总的来说，基因的表达有两种可能性。在持续表达中，基因通过组成型启动子持续 表达，并且相应的蛋白质聚集在细胞中。
[0010] 另一方面，可诱导启动子用于诱导表达。靶基因的表达可以通过诱导物诱导。如果 (过)表达对于生产生物体具有负面作用，则使用这种方法。导致这种情况的原因可能是在 生长期间代谢来源的高荷载。结果是生长减慢及因此延长生物反应器的运行时间及与之相 关的在工业生产中的成本增加。诱导的表达在细胞毒性产物的情况中也是有益的。在此，在 诱导表达后发生细胞的自体中毒和死亡。针对生产方法的经济性，因此尝试将该方法再分 为生长期和生产期。在生长期，产生尽可能大量的生物量，然后在生产期通过启动子诱导产 生靶蛋白质。以此方式，可以获得最大产率，从而该方法成为明显更经济的。
[0011 ] 对于可调节的大肠杆菌(Escherichia coli)启动子lac、APL和trp，已经示出其可 以用于棒状细菌中调节各个基因的表达（Tsuchiya and Morinaga，Bio/Technology 6 (1988)428-431)。
[0012] 可诱导启动子的理想情况是棒状细菌启动子，其由易于获得的非昂贵的物质调 To
[0013] EP 0530765 Bl(Kyowa Hakko)描述了使用棒杆菌的可诱导启动子-在此是异柠檬 酸裂合酶基因的可诱导启动子-以产生酶如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和ICL以及生 理学活性蛋白质，如胰岛素或者α-、β_或λ-干扰素。只要培养基中存在不同于糖的碳源(C 源），这种启动子即可导致基因表达;在存在糖的情况下其被抑制。然而，由于在一般的发酵 培养基中使用糖作为C源，因此有用的是获得可调节启动子，所述启动子即使在存在糖的条 件下使用非昂贵的诱导物也导致基因表达。
[0014] DE 4440118 C1(如US 5965391，FZ Jiilich)保护了来自棒杆菌的可诱导启动子-在此是苹果酸合酶基因 aceB的可诱导启动子-生产蛋白质的用途;在此诱导物是碳源乳酸 盐、丙酮酸盐或乙酸盐。
[0015] Plassmeier等（Journal of Biotechnology 159/1-2(2012))描述了谷氨酸棒杆 菌的prpDBC2操纵子的启动子，其基因是在作为主要C源的丙酸盐上生长所必需的，并且编 码酶2-甲基柠檬酸脱水酶(PrpD2)、2-甲基异柠檬酸裂合酶(PrpB2)及2-甲基柠檬酸合酶 (PrpC2)。启动子测试载体构建体的分析可以鉴别prpDBC2操纵子上长度为121个碱基对的 操纵子区，其是通过激活物PrpR经丙酸盐诱导的转录所必需的。EMSA研究示出2-甲基柠檬 酸盐可能发挥作为PrpR的共激活物的功能。
[0016] 发明目的
[0017]本发明基于如下目的，即生产L-氨基酸L-亮氨酸、L-缬氨酸或L-异亮氨酸、优选L-缬氨酸，或者生产α_酮酸α-酮异戊酸，α-酮甲基戊酸或者α-酮异己酸的新方法，所述方法具 有优选改良的产率和/或细胞内和/或在培养基中更高的产物终浓度。在此，应优选存在比 产率(spezifischen Ausbeute)的改良（即相对于采用的碳源的希望的产物产率）。
[0018] 所述新方法应优选可以不依赖于培养基的主要碳源而调节L-氨基酸和/或α-酮酸 的产生。
[0019] 在新方法中，如果可能，则不希望的副产物的形成、特别是不希望的副产物丙氨酸 的形成应还优选被抑制，因为副产物的分离是非常费力及高成本的，并且对于肉汤的产物 纯度和碳产率具有负面作用。
[0020] 使用的方法应还优选导致用于生产的菌株的遗传稳定性增加，及因此在发酵过程 (培养阶段和主发酵罐)中可以产生大量世代而不降低输出数据。
[0021] 发明描述
[0022]本发明的目的通过使用激活物PrpR结合的操纵基因调苄基因 ilvBN的表达而实 现。
[0023] ilvBN(EC No.4.1.3.18)是编码乙酰乳酸合酶的亚基的基因。
[0024]本发明的目的因此是通过棒杆菌属(Corynebacterium)微生物发酵生产L-氨基酸 或者α-酮酸的方法，所述L-氨基酸选自L-亮氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸，优选L-缬氨酸， 所述α-酮酸选自酮异戊酸、酮甲基戊酸和酮异己酸，所述微生物含有可复制形式的具有操 纵基因活性的多核苷酸，所述多核苷酸序列与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序列的位置1-121的 序列至少85 %、优选至少90 %、92 %、94%或96 %、特别是至少97 %、98 %或99 %、特别优选 100%相同，激活物PrpR与所述多核苷酸结合，并且功能上在所述多核苷酸的下游在3'末端 是具有启动子活性的第二个多核苷酸，以及编码乙酰乳酸合酶亚基的基因 ilvB和ilvN，并 且所述多核苷酸随着添加激活物PrpR而调苄基因 ilvBN的转录，所述激活物PrpR由培养基 中的共激活物2-甲基柠檬酸盐激活，在无诱导物的第一阶段之后，在随后的第二阶段向培 养基中加入丙酸盐或者2-甲基柠檬酸盐作为诱导物，由此ilvBN基因表达及因此在希望的 L-氨基酸或α-酮酸富集在培养基或细胞中的条件下合成希望的L-氨基酸或α-酮酸。
[0025]具有操纵基因活性的多核苷酸优选是在棒状细菌中天然调节2-甲基柠檬酸脱水 酶表达的操纵基因，或者衍生自这种操纵基因的多核苷酸。
[0026]具有操纵基因活性的多核苷酸优选包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:11 所示序列或者与SEQ ID N0:l、2或3所示序列的位置22-49的序列(在下文也称作"IR Γ)至 少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同，以及 还包含这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID Ν0:12所示序列或者与SEQ ID Ν0:1、2或3所示序 列的位置77-105的序列（在下文称作"IR 2"）至少90%、优选至少92%、94%或96%、特别至 少97%、98%或99%、特别优选100%相同。在优选的实施方案中，序列"IR Γ位于具有操纵 基因活性的多核苷酸的位置22-49,在优选的实施方案中序列"IR 2"位于位置77-105。 [0027]在本发明的优选实施方案中，具有操纵基因活性的多核苷酸是较长的多核苷酸的 一部分，所述较长的多核苷酸优选与SEQ ID N0:1、2或3的位置1-177的序列具有至少90%、 优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%的序列相同性。 [0028] 基因 ilvB优选是编码具有与SEQ ID N0:9的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0029]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置499-2379的序列是至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同的。 [0030] 基因 ilvN优选是编码具有与SEQ ID N0:10的氨基酸序列具有至少90%、优选至少 92%、94%或96%、特别至少97%、98%或99%、特别优选100%相同性的氨基酸序列的多肽 的多核苷酸。
[0031]特别优选这样的多核苷酸，其序列与SEQ ID N0:8的位置2393-2911的序列至少 90%、优选至少92%、94%或96%、特别是至少97%、98%或99%、特别优选100%相同。 [0032]由基因 ilvB和ilvN编码的多肽聚集在一起产生功能性乙酰乳酸合酶。
[0033]丙酸盐或丙酸优选用于诱导表达。在这方面，发生"丙酸盐诱导"。丙酸盐在体外被 转变为实际的共激活物2-甲基柠檬酸盐。或者，2-甲基柠檬酸盐也可以直接用于诱导，但是 由于其较低的可用性而不太优选。根据本发明，术语"丙酸盐诱导"也包括用2-甲基柠檬酸 盐诱导。
[0034] 在生产完成后，优选分离希望的L-氨基酸或α_酮酸，发酵肉汤的其它成分和/或生 物量任选以其全部或部分(>〇至100%)保留在分离的产物中或者被完全除去。
[0035] 在本发明的方法中，首先发生生物量的无诱导培养阶段(生长期，第一阶段）。在这 个阶段，优选没有或者几乎没有任何氨基酸或酮酸形成(<5g/l)。在随后的生产阶段(诱导 期，第二阶段），通过丙酸盐或2-甲基柠檬酸盐诱导生物合成基因 ilvBN而诱导生产。培养阶 段包括所有培养步骤，从保留样品开始，通过优选应用摇瓶阶段直至优选应用培养发酵罐。 培养阶段也可以仍包括主发酵的第一阶段。优选地