例，可以应用依赖于其结合状态改变报告-靶复合物的质量的报 告分子。因此，熔解曲线数据可以由报告-靶复合物的重量的信号描述来表示，其是温度的 函数。
[0106] 荧光基团的使用可以类似于使用两种或更多种不同类型荧光基团的方式，与不同 类型的报告分子的使用相结合。例如，如果应用两种荧光基团和依赖于它们的结合状态改 变它们的电化学势的标记分子，能够获得由所研究的溶液发射的光的荧光信号描述表示的 第一熔解曲线，其是温度的函数，和由所研究的溶液的电化学势的信号描述表示的第二熔 解曲线，其是温度的函数，两个熔解曲线都作为熔解曲线数据的表示，因此有利于以与仅靠 单一类型的报告分子的情况相比，更准确且可靠的方式分析熔解行为。
[0107] 返回到焚光基团作为报告分子的一个例子，考虑到核酸分子和焚光基团的上述特 性和它们之间的关系，代表在给定温度下的熔解曲线数据的荧光信号F(T)可根据下式被建 模
[_
… (12)
[0109] 其中参数Fo(T)表示在温度T下在所研究的溶液中由未结合荧光基团发射的光的 例如组合强度的荧光，并且参数FJT)表示在温度T下由结合至种群i的核酸分子的荧光基 团发射的光的例如组合强度的焚光。换句话说，参数Fo(T)可被认为是代表由未结合焚光基 团的种群发射的光，而参数^(1〇可以被认为是代表由结合到核酸分子种群i的分子的荧光 基团种群发射的光，公式（12)从而将荧光信号F(T)估计或表示为两个或多个信号分量的总 和。因此，公式（12)建模在给定温度下整体熔解曲线的荧光信号描述，其是第一信号分量和 一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示在给定温度下由未结合荧光基团发射的 组合光强度，每个第二信号分量表示在给定温度下由结合到相应种群的核酸分子的荧光基 团发射的组合光强度。公式(12)可以被写为
[0110]
(13)
[0111]其中参数n〇(T)表示在温度T未结合荧光基团的相对数量，参数m(T)代表在温度T 结合到种群i的核酸分子的荧光基团的相对数量，参数/函数n〇,tclt(T)表示在温度τ单个未结 合荧光基团的平均发射效率，并且参数/函数ru.tcWT)代表在温度T结合到种群i的核酸分子 的单个荧光基团的平均发射效率。公式（13)可被认为提供第一信号分量，其是第一项n〇(T) 和第二项ηο,Μ(Τ)的乘积，并提供各第二信号分量，其是各第三项m(T)和各第四项ru,tclt(T) 的乘积。
[0112] 未结合荧光基团的数量η〇(Τ)和结合到核酸分子的荧光基团数量m(T)是相对的， 因为它们并不一定需要指示荧光基团的实际相应数量，但n〇(T)和m(T)的值足以指示未结 合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个核酸分子种群的每个的荧光基团的实际 数量的比值一或以另一种方式，指示未结合荧光基团的实际数量和结合到所述一个或多个 核酸分子种群的每个的荧光基团的实际数量，相对于荧光基团的总体数量n tclt的比值。因 此，作为一个例子，结合到第一给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量m(T)相对于结 合到第二给定种群的核酸分子的荧光基团的相对数量r^(T)用作在所研究的溶液中第一给 定种群的核酸分子相对于第二给定种群的核酸分子的浓度的指示。
[0113] 如前所述，荧光基团的发射效率可通过合适的温度函数，例如根据公式（1)或（2) 的函数被建模。作为一个例子，如果假设根据公式（1)的模型表不焚光基团的发射效率，公 式（13)可以写为
[0114]
[0115] 公式（14)因此可以被认为是由一个参数函数提供建模公式（13)的第二项的一个 例子，该参数函数是未结合荧光基团的发射效率的描述，其是温度的函数，并且将公式（13) 的各第四项建模为相应的参数函数，该参数函数是结合到相应核酸分子种群的荧光基团的 发射效率的描述，其是温度的函数。
[0116] 作为一个例子，如果进一步应用根据公式(8)的模型，其确定为未结合荧光基团的 函数的占用水平nKO/NdT)，将公式(9)代入式(14)，得到：
[0117]
5
[0118] 从而从公式中消除结合在每个核酸分子种群中的荧光基团的相对数量m(T)。因 此，公式（15)可以被认为是将公式（13)的每个第三项建模成为在给定温度下用于核酸分子 各种群的结合位置的总体数量和所述结合位置的总体数量的占用水平描述的参数函数值 的乘积的一个例子，该参数函数是溶液中未结合荧光基团的相对数量的函数。
[0119] 此外，由于用于给定核酸分子种群的结合位置的总体数量可以如前文所述被建 模，例如，其可以用公式(5)替代Ni(T)，以改写式(15)为
[0120]
[0121]因此，公式（16)用作一个例子，其将用于公式（15)的给定核酸分子种群的结合位 置的总体数量建模为参数函数，该参数函数是各种群的核酸分子的熔解概率的描述，其是 温度的函数。
[0122] 将熔解曲线数据表示为温度函数的荧光信号F(T)可以基于在感兴趣的温度范围 内的多个测量，其中所测量的信号KT)可能涉及不准确性和可能甚至测量误差。作为一个 例子，该荧光信号F(T)可基于公式(17)得到。
[0123] I(T)=A · F(T)+B (17)
[0124] 其中项A是调整因子并且项B是偏移，从而提供线性失真的示例性模型。例如，调整 因子A和偏移B可能由以下原因引起，所采用的用于测量荧光信号F(T)的设备的特性，诸如 光检测器性质，所采用的作为设备的一部分的可能的放大器的增益，所采用的作为设备的 一部分的模拟-数字转换器的特性等。因此，某些校正和/或补偿可以被进行以补偿和/或最 小化所测量的信号失真的影响，以便基于测量信号KT)获得荧光信号F(T)。因此，由于校正 和/或补偿可能影响荧光信号F(T)的绝对值，服从例如基于公式（12)至（16)中的一个的建 模的荧光信号F(T)可以是标准化的荧光信号F n_(T)。标准化可能涉及例如在给定的参考 温度，将标准化的荧光信号Fn_(T)的值设置为给定的参考值，例如设为值1，并且例如根据 公式（18)，相应地使荧光信号F(T)的其金倌标准化。
[0125] t 、 (18)
[0126] 因为它通常足以考虑跨越感兴趣的温度范围的相对荧光，为了确定核酸分子种群 的相对浓度和/或所采用的荧光基团的温度相关行为，应用标准化的荧光信号F n〇rm(T)代替 (近似)荧光信号F(T)，所述F(T)是基于对所测量的信号I(T)施加校正和/或补偿获得的，在 这方面不影响建模的结果。
[0127] 尽管在这里在公式（17)的上下文中被描述，标准化可被应用于任何荧光信号，例 如应用于基于不同的、可能的非线性、失真模型获得的荧光信号，或甚至通过未知推导手段 获得的荧光信号。此外，标准化可以利用不同于公式(18)中的例举的参考温度和/或通过使 用不同标准化方案进行。
[0128] 鉴于上述情况，由公式（12)在概念层次描述的熔解模型和在公式（13)至（16)中采 用各种例举的进一步层次的细节可被用于溶液的熔解曲线分析，所述溶液包括核酸分子的 一个或多个种群和恒定数量的至少单一类型的荧光基团。
[0129] 作为一个例子，图9描绘了流程图，其示出了用于分析熔解曲线的方法900,其表征 溶液的熔解，所述溶液包括一种或多种类型的核酸分子和恒定数量的至少第一类型的荧光 基团。方法900包括如步骤910中所指出的获得熔解在感兴趣的温度范围内的熔解曲线数据 的荧光信号描述。荧光信号表示由所述第一类型的荧光基团发射的光的强度，其是温度的 函数。方法900还包括按照如通过公式（13)至（16)中的一个所描述的熔解模型，在感兴趣的 温度范围内的多个温度下，建模所获得的荧光信号，如方框920所示。也就是说，由公式（13) 至（16)所述的熔解模型被应用于估计或表示荧光信号。方法900还包括利用数值分析确定 所应用的熔解模型的项或其参数的值，以表征熔解的各分量，如方框930所示。方法900可以 进一步包括输出数值分析的结果，例如提供该结果以将其显示在仪器的显示装置上，或提 供该结果用于存储在该装置的存储器中，以用于在该装置或另一装置中的随后进一步使 用。可能被应用于执行在方框910,920和930中所示的过程的功能、操作和/或程序的非限制 性实例将在下文中被描述。
[0130]获得荧光信号(方框910)可以包括，例如，从存储设备，例如从计算机的存储器中 读取预组成的荧光信号。作为另一实例，获得荧光信号可包括将所研究的溶液暴露于感兴 趣的温度范围内的多个温度，而在同一时间使用合适波长的光激发溶液，以使其中的荧光 基团在一个波长发射光，该波长是所采用的荧光基团的类型的特征，并捕获代表所发出的 光的信号，作为熔解曲线数据的荧光信号描述。作为进一步的例子，该荧光信号可通过将也 是熔解曲线数据的描述的另一种类型的源信号，转换成(直接)代表由所述荧光基团发射的 光的强度的作为温度函数的荧光信号而获得。作为一个例子，该荧光信号可基于作为温度 函数的熔解曲线的负一阶导数的信号描述获得。这样的源信号可被获得作为熔解分析的结 果，因为它将(平均)熔解温度方便地表示为信号中的峰值。
[0131 ]建模所获得的焚光信号(方框920)可包括例如根据公式（12)在多个温度的每一个 下，将荧光信号建模为第一信号分量和一组第二信号分量的总和，所述第一信号分量表示 在给定温度下由溶液中的所述第一类型的未结合荧光基团发射的组合光强度，每个第二信 号分量表示在所述给定温度下由结合到核酸分子相应种群的所述荧光基团发射的组合光 强度。根据公式（13)，第一信号分量可被提供为第一项和第二项的乘积，所述第一项表示在 所述给定温度下所述第一类型未结合荧光基团的相对数量，并且所述第二项表示在所述给 定温度下所述第一类型未结合荧光基团的发射效率。每个第二信号分量被提供为相应的第 三项和相应的第四项的乘积，所述第三项表示在所述给定温度下，结合到核酸分子相应种 群的所述荧光基团的相对数量，并且所述第四项表示在所述给定温度下结合到核酸分子的 相应种群的所述荧光基团的发射效率。而且，根据公式（13)的熔解模型的第二项可例如根 据按照公式（1)或公式(2)的参数函数被进一步建模，根据公式（13)的每个所述第三项可例 如根据公式(9)和可能进一步例如通过公式(5)或公式(7)进一步被建模，这取决于熔解模 型的预期应用和关于熔解模型的项和/或参数的值的可能先验知识。
[0132] 利用数值分析(方框930)可以包括利用数值分析确定在所述多个温度下，所述第 一项、所述第二项、每个所述第三项和每个所述第四项的值，使得所获得的荧光信号和所建 模的荧光信号之间的差满足预定标准。所获得的荧光信号与所建模的荧光信号之间的差满 足预定标准可包括例如差最小化成本函数。如果荧光信号在公式（13)的基础上直接被建 模，在所述多个温度下第一、第二、第三和第四项的值可以直接被确定。如果荧光信号例如 在公式（14)至（16)中的一个的基础上被建模，其中所述第二、第三和第四项中的一个或多 个可基于相应参数函数被建模，为由一个或多个参数函数表示的项确定值可以包括确定相 应参数函数的参数值。
[0133] 在某些情况下，熔解模型的一个或多个参数值是预先知道的。因此，利用数值分析 确定熔解模型的第一、第二、第三和第四项的值可以包括在感兴趣的温度范围内的多个温 度下，将所述项中的至少一个设置为相应的预定值，并采用数值分析确定在所述多个温度 下熔解模型的其它项的值。这因此意味着在熔解模型中代入项和/或参数的预定值，并应用 数值分析导出剩余未知项和/或参数的值。
[0134] 方法900还可以被应用于分析熔解曲线，其表征溶液的熔解，所述溶液还包括恒定 数量的第二类型荧光基团。对于这样的应用，方法900可以进一步包括应用在方框910的上 下文中所描述的过程，以便获得表示由第二类型荧光基团发射的光的强度的第二荧光信 号，应用在方框920的上下文中所描述的过程，以通过采用类似于施加于(第一)荧光信号的 方法来建模第二荧光信号，并应用在方框930的上下文中所描述的过程，以利用数值分析来 确定熔解模型的第一项、第二项、各第三项和各第四项的值，使得所获得的第二荧光信号和 相应的建模的荧光信号之间的差满足预定标准。因此，例如基于第一类型荧光基团或基于 第二类型荧光基团确定的用于第