专利名称：一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种口腔常见病原菌伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉 单胞菌的多重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
人类口腔中大约寄居着500多种细菌，其中约300余种生长于龈下环境，研究表明几乎 所有类型的牙周病都是由牙周菌斑细菌感染所致，但只有少数几种细菌由于单独或协同作用 引起牙周组织破坏，细菌及其代谢产生的毒性产物包括细菌的抗原成分，各种酶，毒素及许 多代谢产物可直接刺激和破坏牙周组织，或引起牙周组织局部的免疫反应，造成组织损伤， 这是导致牙周病变的主要原因。
目前认为牙龈卟啉杆菌和伴放线放线杆菌分别是成人牙周炎和青少年牙周炎特异的病 原体，牙龈吓啉单胞菌主要引起牙周组织的急性感染，是成人牙周炎的特异病原体；而伴放 线放线杆菌可能是局限性青少年牙周炎的重要致病菌；福塞类杆菌参与成人牙周炎的发生发 展；具核梭杆菌也在成人牙周炎和青少年牙周炎发病中发挥作用，这些细菌的检出数量、频 率与炎症破坏程度之间存在着正相关关系，其单独或协同作用造成牙周组织的破坏。
牙周炎致病菌的研究一直是研究的热点，建立快速、敏感的检测方法对于研究牙周病的 发病机制、监测牙周病的病情变化、确定治疗方案有着非常实际的意义。细菌的分离培养是 检测口腔厌氧菌的传统的方法，即将临床标本处理稀释后接种于适当的培养基上，获得单个 菌落，再进行染色和生化反应鉴定，但病原菌的培养常受到培养营养要求、标本运送时间及 培养时间等因素的限制， 一般实验室难以进行，不能满足临床要求。因此人们一直在研究试 图找到特异、灵敏和快速的检测方法。随着PCR技术的出现及不断完善，用PCR方法检测病 原菌的研究报道越来越多，也越来越成熟。已有文献报道用PCR技术分别检测病原菌的研究 报道，受到临床的欢迎，为了进一步提高检测效率，利用多重PCR技术同时扩增4种细菌， 但根据一般性原则，在PCR反应中，不同的引物需要选定不同的反应条件才能使PCR反应 最佳，在同一反应中，所加引物越多，越难以选择适合的反应条件。在进行多重PCR引物设 计中，除应遵循一般引物设计原则，还应注意1)使所用引物的熔解温度(Tm)尽可能一 致，以保证在同一反应条件下的扩增结果；2)尽可能减少所用引物，针对伴放线放线杆菌、 福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌设计了一条共用下游引物；3)使6条引物扩增片段大小有相 当的差异，以保证在琼脂糖凝胶电泳中有良好的分辨率。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种口腔致病菌伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核 梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的多重PCR快速检测方法，仅通过一次PCR扩增就可同时检测上 述四种口腔致病菌。
一种口腔致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR扩增口腔致病菌中 的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，再通过电泳检 测特异基因。所述多重PCR扩增口腔致病菌中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟 啉单胞菌的特异基因，包括如下步骤-
1) 采用热裂解法提取DNA模板，具体步骤如下
挑取口腔中待测菌置于200ial裂解缓冲液中，IOO'C水浴10min，取3^1清液，即得模板 DNA，留存备用；
2) 多重PCR扩增伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异 基因，具体步骤如下
反应体系总体积为25pl
H20 14.25^1，
缓冲液(10xPCR) 2.5^1，
MgCl2 (25mM) 2^il， dNTP (0、M)
引物混合液(10pM) 2pl，
DNA聚合酶(0.5U) 0.25^1，
模板DNA 3|al; 引物
伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌的下游引物为共有引物
5' -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3， (引物1);
伴放线放线杆菌的上游引物为5' -ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3' (引物2); 福塞类杆菌的上游引物为5， -TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3' (引物3); 牙龈叶啉单胞菌的上游引物为5' -TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3，(引物4); 具核梭杆菌的上游引物为5， -CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3' (引物5); 具核梭杆菌的下游引物为5' -TTTAGAAATGGTAGAATA AT-3' (引物6); PCR反应循环参数为
94°C 5min; 94°C 30sec、 55。C 30sec、 72°C 40sec， 30个循环;72。C延伸7min; 吸取14.25^1无菌去离子水加至微离心管中，再依次加入10xPCR缓冲液2.5nl， 25mM MgCl2 2^1， 0.2pM dNTPl(al， lOpM引物混合液2nl, 0.5U DNA聚合酶0.25|_il，模板DNA 3^1，
将微离心管置于离心机，10000转/分离心混匀1分钟，再将微离心管放入PCR仪中，按照 设定的参数进行PCR扩增反应；制得特异基因溶液。 3)电泳检测鉴定
对上述特异基因溶液进行电泳检测，电泳图中含有长度为360bp、 745bp、 500bp或197bp 相应特征位置条带的一种或多种，分别对应于样本含有伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核 梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的一种或多种。
所述步骤1)中的裂解缓冲液为1.0mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1.0% Triton(聚乙 二醇辛基苯基醚)X-IOO， 10咖ol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl，pH8. 0。
所述步骤3)电泳检测鉴定的具体操作方法如下
以TAE缓冲液配制2y。 (w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至50 6(TC时，加 入溴化乙锭，使溴化乙锭终浓度为lpg/ml，充分混匀，倒入胶膜中，放好梳子，待胶凝固后， 移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面1 2mm;再将PCR扩增后的特异基因溶液与TAE缓冲液以1: IO体积比混合，用微量移液器将该混合液 (样品)依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通电，80V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，
电泳25 35min后，切断电源，取出凝胶，在紫外光下观察。电泳图中含有长度为360bp、
745bp、 500bp或197bp相应特征位置条带的一种或多种，分别对应于样本含有伴放线放线
杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的一种或多种。
TAE缓冲液为含EDTA (p朋.0)和Tris-盐酸的缓冲液，为本领域常用试剂。 本发明所提及的操作方法、培养基和实验试剂如无特别说明，均为本领域常规操作、培
养基和市售试剂。
本发明通过对伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的引物设计， 使得多重PCR快速检测中，反应条件一致，方法敏感、特异性强，能同时对标本中的上述四 种细菌进行检测鉴定，大大提高了检测的速度和效率。利用本发明所述的伴放线放线杆菌、 福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌多重PCR快速检测方法可为研究牙周病的发病机 制、临床监测牙周病的病情变化、确定治疗方案提供重要依据。
图l为实施例l的检测电泳图；其中，M道DL2000标记；1道福塞类杆菌+伴放线 放线杆菌+牙龈卟啉单胞菌；2道福塞类杆菌+牙龈卟啉单胞菌；3道福塞类杆菌+具核梭 杆菌+伴放线放线杆菌+牙龈卟啉单胞菌。
具体实施例方式
下面结合图l和实施例对本发明作进一步的描述，但本发明保护范围不仅限于此。 实施例1:
一种伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌多重PCR快速检测方
法，利用多重聚合酶链式反应(PCR)同步检测伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌
和牙龈B卜啉单胞菌四种病原菌，步骤如下
(1) 牙周袋及龈沟标本的采集采用无菌纸尖法从患者牙周袋内最深处或牙周健康者 牙龈沟内分别采集标本，具体采集方法如下常规清水漱口后，生理盐水冲洗去除食物残渣， 吹干，棉球隔湿，局部用2.5%碘酊棉球消毒，将1片无菌纸尖插入牙周袋内或龈沟内，当 有阻力时停止插入，停留30s后取出，置于常规厌氧转送培养基中，转接入转种培养基中，
4。C保存3h。
(2) 细菌培养由转种培养基中取出纸片，接种于牛心脑浸液(brain heart infusion, BHI) 培养基，在80°/美、10%C02、 10%仏的气体环境下，37。C厌氧培养48h。
(3) 模板DNA的制备:观察不同菌落的形态，挑取各种菌落置于200^1裂解缓冲液 (1. 0腿ol/L EDTA， 1. 0% Triton X-100， 10画1/L Tris-HCl, pH8. 0)中，100。C水浴10min，
取3 y 1上清液直接作为PCR的DNA模板。
(4) 多重PCR反应
吸取14.25^1无菌去离子水加至微离心管中，再依次加入10xPCR缓冲液2.5^1， 25mM MgCl2 2^1， 0.2pMdNTPlnl， lO^M引物混合液2pl， 0.5UDNA聚合酶0.25(il，模板DNA3|al， 将微离心管置于离心机，10000转/分离心混匀1分钟，再将微离心管放入PCR仪中，按照 如下参数进行PCR扩增反应94。C5min; 94。C30sec、 55。C30sec、 72。C40sec， 30个循环； 72。C延伸7min;进行多重PCR扩增时，伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌的下游引物为共 有引物5，-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3';伴放线放线杆菌的上游引物为5' -ATTGGGGTTTAG CCCTGGTG-3'，福塞类杆菌的上游引物为5' -TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3'，牙龈外啉 单胞菌的上游引物为5， -TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3，；具核梭杆菌的上游引物为 5， -CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3'，下游引物为5' -TTTAGAAATGGTAGAATAAT-3，。
以TAE缓冲液配制2。/。 (w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至60'C时，加入溴 化乙锭，使其终浓度为lpg/ml，充分混匀，倒入胶膜中，放好梳子，待胶凝固后，移去梳子， 将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面2mm;再将PCR后的样品与 TAE缓冲液以h IO体积比混合，用微量移液器将样品依次加入加样孔内，盖上电泳槽并通 电，80V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳30min后，切断电源，取出凝胶，在紫 外光下观察，图谱分析根据有无伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞 菌的多重PCR产物预期扩增片段来判断是否含有上述细菌。无伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、 具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的多重PCR产物预期扩增片段长度分别为360bp、 745bp、 500 和197bp。如图1所示，1道为检测菌中含有福塞类杆菌+伴放线放线杆菌+牙龈卟啉单胞菌； 2道为检测菌中含有福塞类杆菌+牙龈卟啉单胞菌；3道为检测菌中含有福塞类杆菌+具核梭 杆菌+伴放线放线杆菌+牙龈卟啉单胞菌。序列表
<110> 肖水清
〈120〉 一种口腔致病菌的多重PCR快速检测方法 <160〉 6
〈170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211〉 20
<212〉 DNA
<213〉人工合成
<400> 1
ACGTCATCCC CACCTTCCTC 20
<210> 2
〈211〉 20
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 2
ATTGGGGTTT AGCCCTGGTG 20
<210> 3
<211〉 24
〈212〉 DNA
〈213>人工合成
<400> 3
TACAGGGGAA TAAAATGAGA TACG 24
〈210> 4
〈211〉 24
<212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 4
TGTAGATGAC TGATGGTGAA AACC 24
<210> 5
<211〉 23
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 5
CAAATGCTTG TGTCAATAAT ACT 23
<210〉 6
〈211〉 47
〈212> DNA
<213〉人工合成
〈400〉 6
TTTAGAAATG GTAGAATAAT 20
权利要求
1、一种口腔致病菌多重PCR快速检测方法，其特征在于，采用多重PCR扩增口腔致病菌中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，再通过电泳检测特异基因。
2、如权利要求1所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增口腔中 的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，包括如下步骤:1) 采用热裂解法提取DNA模板，具体步骤如下挑取待测菌置于20(^1裂解缓冲液中，IOO'C水浴10min，取3pl清液，即得模板DNA， 留存备用；2) 多重PCR扩增伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因， 具体步骤如下反应体系总体积为25plH20 14.25(xl，缓冲液(10xPCR) 2.5^1，MgCl2 (25mM) 2p，dNTP (0.2一) lpl，引物混合液(10pM) 2(il，DNA聚合酶(0.5U) 0.25|^1，模板DNA 3^1; 引物伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、牙龈卟啉单胞菌的下游引物为共有引物-5' -ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3 ， (引物1);伴放线放线杆菌的上游引物为5' -ATTGGGGTTTAGCCCTGGTG-3， (引物2); 福塞类杆菌的上游引物为5' -TACAGGGGAATAAAATGAGATACG-3' (引物3); 牙龈P卜啉单胞菌的上游引物为5' -TGTAGATGACTGATGGTGAAAACC-3'(引物4); 具核梭杆菌的上游引物为5' -CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3' (引物5); 具核梭杆菌的下游引物为5' -TTTAGAAATGGTAGAATA AT-3' (引物6); PCR反应循环参数为94°C 5min; 94°C 30sec、 55°C 30sec、 72°C 40sec， 30个循环；72。C延伸7min;吸取14.25^1无菌去离子水加至微离心管中，再依次加入10xPCR缓冲液2.5^1, 25mM MgCl2 2^1， 0.2|iM dNTPlpl， lO(iM引物混合液2^1， 0.5U DNA聚合酶0.25^1，模板DNA3pl， 将微离心管置于离心机，10000转/分离心混匀1分钟，再将微离心管放入PCR仪中，按照 设定的参数进行PCR扩增反应；制得特异基因溶液； 3)电泳检测鉴定对上述特异基因溶液进行电泳检测，电泳图中含有长度为360bp、 745bp、 500bp或197bp 相应特征位置条带的一种或多种，分别对应于样本含有伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核 梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的一种或多种。
3、如权利要求2所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述步骤l)中的裂解缓冲液为l.0 mol/L EDTA， 1.0% Triton X-100， 10,1/L Tris-HC1， pH8. 0。
4、如权利要求2所述的多重PCR快速检测方法，其特征在于，所述步骤3)电泳检测鉴定的具体操作方法如下以TAE缓冲液配制2。/。 (w/v)琼脂糖凝胶溶液，加热溶解，待冷却至50 60'C时，加 入溴化乙锭，使溴化乙锭终浓度为lpg/ml，充分混匀，倒入胶膜中，放好梳子，待胶凝固后， 移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入TAE缓冲液，使液面高出凝胶表面1 2mm;再将 PCR扩增后的特异基因溶液与TAE缓冲液以1: IO体积比混合，用微量移液器将样品依次 加入加样孔内，盖上电泳槽并通电，80V恒压电泳，使DNA向阳极方向移动，电泳25 35min 后，切断电源，取出凝胶，在紫外光下观察。
全文摘要
本发明涉及一种口腔常见病原菌伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的多重PCR快速检测方法，属于分子生物学技术领域。利用多重PCR扩增口腔中的伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌的特异基因，并利用电泳检测特异基因。本发明通过对伴放线放线杆菌、福塞类杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌的引物设计，使得多重PCR快速检测中，反应条件一致，方法敏感、特异性强，能同时对标本中的上述四种细菌进行检测鉴定，准确的判断出不同细菌的感染，大大提高了检测的速度和效率。
文档编号C12Q1/68GK101270381SQ200810015998
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者毅 刘, 刘晓华, 张体勇, 肖水清 申请人:肖水清