专利名称：生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒及制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学试剂制备和基因工程应用领域，具体说是一种通 过基因工程手段构建的超级质粒及其制备方法，该超级质粒用于使用限制性 内切酶酶切的方法制备偶数200bp梯度DNA分子量标准。
背景技术：
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的 DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种己知 分子量的DNA混合标准物(分子量标准、DNA marker)同时进行电泳，通过 比较待测DNA分子与DNA分子标准在电泳过程中的迁移距离来判断DNA样 品分子的大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA片段混合物。
现有技术中制备标准DNA的方法己有多种方法
化学合成法通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苦酸腺嘌呤 (dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞嘧啶dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)结合在一 起，合成目标大小的DNA片段。该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA 长度受到严重的限制， 一般可合成DNA的长度不超过400hp，大分子量的 DNA片段无法直接用化学合成法来合成，成本太高，因而不适用DNA分子量 的常规制备。
片段连接法先用PCR或者合成的方法获得小分子量的DNA分子(如 100bp)，再用酶促连接反应将小分子DNA—个一个顺序连接起来，形成不同 大小的DNA分子(100 bp、 200 bp、 300 bp、 400 bp、...)。该方法理论上讲 可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，可再现性差，无法实现 大规模制备。
聚合酶链反应法DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片般的 制备。目前国内外已被广泛用来制备DNA分子量标准物。但是该方法费时费 力，其生产能力有限。
酶切法用一种或两种限制性内切酶组合对噬菌体DNA或人工设计的质 粒进行切割，产生不同大小的DNA片段，以作为DNA分子量标准。该方法的 优点是容易大量制备，产率高。但该方法的缺点也很突出酶切产生的DNA 片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，其制约因素是人工构建质粒的设 计水平。
长期以来，分子生物学试剂与基因工程应用领域，需要一种高水平的人 工构建质粒设计，以克服酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类 的限制，以快速、精确、大量地生产偶数200bp梯度DNA分子量标准。
发明内容
经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，其目的在于提供一种通过基因工程手段构建的、全新的、能够快速、精确、大量地通过酶 切方法生产200bp偶数梯度DNA分子量标准的超级质粒。
本发明能够的进一步目的在于提供一种生产200bp偶数梯度DNA分子量 标准的超级质粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案
通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增了 400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp几条片段，其中1400bp和1000bp通过pfii DNA聚合 酶进行扩增，而400bp-A、 400bp-B、 600bp、 800bp分别用Taq DNA聚合酶进 行扩增。然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1400bp和1000bp两条片段加 T。再利用A/T互补的原理在离心管中建立连，体系，利用T4连接酶使600bp、 800bp、 1000bp连接成一个600-800-1000的单元，同样400bp-A、 400bp-B、 1400bp 连接成400A-1400-400B的单元。然后通过T/A克隆试剂盒，把上述两个单元分 别克隆到T载体中形成中间载体T681和T4144。
通过Pst I酶切将400A-1400-400B单元从T4144中切出来，并利用核酸纯化 回收试剂盒进行回收和纯化。同时T681载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用 小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。建立合适的 连接体系，把400-1400-400单元连接进脱磷处理的T681载体所得中间载体命名 为T6814144。通过与上述过程相近的技术路线，利用PCR方法从LambdaDNA 中扩增获得一个2000bp的片段，并克隆到T载体中，然后用内切酶SphI再切 出来，连入同样Sphl酶切和CIAP脱磷处理的T6814144，获得超级质粒，命名 为pYE9600。
所获得的超级质粒pYE9600是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中 含有400bp、 600 bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp六条片段，其中400bp 为双拷贝，以增强其观察时的荧光强度。质粒经EcoRI酶切后可以获得一个由7 条片段组成的200bp偶数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质
量)之间具有一定的比列关系(4: 3: 4: 5: 7: 10: 15)。
本发明的有益效果在于利用成熟的生产工艺和基因工程构建了一种人工超
级质粒，该质粒是一种全新的DNA分子量标准质粒，对该质粒进行切割制备 200bp偶数梯度DNA分子量标准，克服了传统的酶切法产生的DNA片段大小受 到所用的限制性酶种类的限制，容易大量制备，产率高。实现了本发明的目的。
图1是生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒pYE9600图谱。
具体实施例方式
生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制备方法，具体包括如下 歩骤
1. 通过PCR的方法分别扩增400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000 bp几条片段，其中1400bp和1000bp通过pfuDNA聚合酶进行扩增，而400bp、 600 bp、 800 bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。 -
2. 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1400 bp和1000 bp两条片段加T。
3. 利用A/T互补在离心管中建立连接体系，使600bp、 800bp、 lOOObp连接 成600-800-1000的单元，400bp和1400bp连接成400-1400-400的单元。
4. 通过T/A克隆试剂盒，把上述的600-800-1000、 400-1400-400两个单元分别克隆到T载体中形成中间载体T681和T4144。
5. 通过Pst I酶切将400-1400-400单元从T4144中切出来，并回收。同时T68I 载体也被Pst I酶切完全酶切，并利用CIAP进行载体脱磷处理，以防止载体自连。
6. 把400-1400-400单元连接进上述的脱磷处理的T681载体所得中间载体 T6814144。
7. CIAP脱磷处理T6814144。
8.2000bp克隆到T载体中，然后用内切酶Sph I再切出来，连入同样SphI 酶切和CIAP脱磷处理的T6814144,获得质粒pYE9600。
该质粒是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有400bp、 600 bp、 800bp、 1000bp、400bp、 2000bp、 3000bp七条片段，其中400bp为双拷贝，以 增强其观察时的荧光强度。质粒经EcoR I酶切后可以获得一个由7条片段组成 的200bp偶数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质量)之间具
有一定的比列关系(4: 3: 4: 5: 7: 10: 15)。
权利要求
1.生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒，该质粒是一种全新的超级DNA分子量标准质粒，其特征在于其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp七条片段；400bp为双拷贝；经EcoR I酶切后可以获得一个由7条片段组成的200bp偶数DNA分子量标准梯度；同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。
2. 根据权利要求1所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒 的制备方法，包括通过PCR的方法分别扩增400bp、 600bp、 800bp、 1000bp、 1400bp、 2000bp几条片段，其特征在于(1) 对400 bp、 600 bp、 800 bp分别通过普通Taq DNA聚合酶进行扩增；(2) 对1400bp、 1000bp分别通过p/wDNA聚合酶进行扩增；(3) 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1400 bp和1000 bp两条片段加T;(4) 利用A/T互补在离心管中建立连接体系，使600bp、 800bp、 1000bp 连接成600-800-1000的单元，400bp和1400bp连接成400-1400-400的单元；(5) 通过T/A克隆试剂盒，把上述的600-800-1000、 400-1400-400两个单 元分别克隆到T载体中形成中间载体T681和T4144;(6) 通过Pst I酶切将400-1400-400单元从T4144中切出来，并回收；同 时T681载体也被Pst I完全酶切，并利用CIAP进行载体脱磷处理；(7) 把400-1400-400单元连接进上述的脱磷处理的T681载体获得中间载 体T6814144;(8) 将2000bp片段克隆到T载体中，然后用内切酶SphI再切出来，连入 同样Sph I酶切和CIAP脱磷处理的T6814144，获得超级质粒pYE9600。
3. 根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒 制备方法，其特征在于所述的400bp、 600bp、 800bp分别通过聚合酶进行扩 增，具体是指用TaqDNA聚合酶进行扩增。
4. 根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒 制备方法，其特征在于所述的1400 bp、 1000bp分别通过聚合酶进行扩增，具 体是指用pfuDNA聚合酶进行扩增。
全文摘要
利用Taq DNA聚合酶的加尾活性和对连接产物的选择性凝胶回收，构建了一种全新的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒。该质粒是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有400bp、600bp、800bp、1000bp、1400bp、2000bp、3000bp七条片段，其中400bp为双拷贝，以增强其电泳后染色观察时的荧光强度。质粒经EcoR I酶切后可以获得一个由7条片段组成的200bp偶数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(4∶3∶4∶5∶7∶10∶15)。克服了传统的酶切法产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，容易大量制备，产率高。
文档编号C12N15/11GK101575601SQ200810015779
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者叶春江 申请人:济南大学