一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物快速检测技术领域，尤其是涉及一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法。
【背景技术】
[0002]目前，由黄色葡萄球菌引起的食物中毒是越来越多的，据美国疾病控制中心报告表示，由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒是居首位的，占整个细菌性食物中毒的33 %，加拿大甚至高达45 %。金黄色葡萄球菌是食物中毒、菌群失调性腹泻的主要病原体，其不仅在食品污染中占据着十分重要的位置，同时也是临床上非常重要的感染病原体之一，它与艾滋病、乙型肝炎并列为世界的三大感染顽疾。
[0003]现今，金黄色葡萄球菌的检测方法主要有传统的免疫学检测法、核酸检测法和分离鉴定法等，其中，分离鉴定法耗时耗力，而其它两种方法要求均微生物信号的转化、富集，近年来，利用量子点的荧光特性以及功能磁珠的快速分离富集的方法被广泛的应用，但是，该法的检测效率高低部分取决于磁珠的捕获效率，降低了检测信号的富集。而本发明中描述的使用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，由于是对所有菌体的拦截，这就保证了检测信号的有效富集，同时对于过滤而出的CdTe量子点和抗体的复合物可进行重复循环使用，增加了抗体的利用率，最大化减少损失，降低成本。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明创造旨在提供一种快速富集与CdTe量子点荧光结合上的金黄色葡萄球菌的方法，并以量子点的荧光颜色为检测信号来检测金黄色葡萄球菌的存在。
[0005]为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的:
[0006]采用无菌注射器与0.45um滤膜的组合，是将微孔滤膜连接在注射器上，将菌体和抗体及量子点的混合物过膜，对量子点荧光信号进行富集。
[0007]本发明的富集方法对通过抗体用量子点标记金黄色葡萄球菌中的荧光信号有很强的富集功能。
[0008]本发明还公开了富集方法的检测操作步骤:
[0009](1)以谷胱甘肽为稳定剂水相开放体系合成(MTe量子点；
[0010](2)EDC活化CdTe量子点的羧基，与金黄色葡萄球菌特有基因IsdA的兔抗抗体25°C共培养lh，连接，超滤，设置空白对照；
[0011](3)取lml对数期的金黄色葡萄球菌，离心，PBS洗涤，加入步骤(2)得到的CdTe量子点和抗体的复合物，30-33°C共同培养l_4h，同时取lml对数期的金黄色葡萄球菌，离心，PBS洗涤，不加入步骤⑵得到的CdTe量子点和抗体的复合物，30-33°C培养l_4h，作为空白对照；
[0012](4)将共培养的混合物吸入lml的无菌注射器中，用0.45um的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换针头，分别用PBS、PBST洗涤三次，紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则无，空白对照组经洗涤均无荧光。将0.45 μ m滤膜放入无菌注射器组合应用。共培养的混合物就是指30-33°C下，量子点抗体复合物、金葡菌共同培养l_4h后的混合物
[0013]本发明利用量子点荧光作为信号，无菌注射器和滤膜组合进行信号分离放大，紫外光快速检测。该法可用于对微生物化学信号的进行富集，适用于各种微生物化学发光信号的富集，具有潜在的开发应用价值。
[0014]相对于现有技术，本发明创造所述的快速富集与金黄色葡萄球菌结合上的CdTe量子点荧光的方法及应用在金黄色葡萄球菌检测中具有以下优势:
[0015]本法采用量子点作为检测信号，并用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，借助紫外进行检测，此法快速，简便，准确。首先CdTe量子点具有非常稳定的光学特性，这就保证了最终检测信号的稳定性；其次，抗体的特异性以及专一性决定了实验的准确性，最后，仅用注射器和滤膜即可进行富集，快捷，简单。由于是对所有菌体的拦截，这就保证了检测信号的有效富集，同时对于过滤而出的CdTe量子点和抗体的复合物可进行重复循环使用，增加了抗体的利用率，最大化减少损失，降低成本。本法可衍生应用于其它微生物检测，相对于国标检测的方法，本法更为快速，简便，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0016]构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
[0017]图1 CdTe量子点紫外荧光发光图。
[0018]图2为本发明创造实施例所述的无菌注射器与滤膜的实际操作组合。
[0019]图3为本发明创造实施例所述的金黄色葡萄球菌经膜富集后的量子点荧光的紫外发光图。
【具体实施方式】
[0020]为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
[0021]下述实施例中所述CdTe量子点为自己合成，合成方法为称量80mgTe粉和50mg的NaHB4置于干燥的烧瓶中，均匀混合，加入lml超纯水，橡皮塞封口，在橡皮塞上插入一针头，室温下反应6小时。
[0022]IsdA兔抗抗体、金黄色葡萄球菌标准菌株为实验室现存，其他(lml无菌注射器、
0.45um滤膜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠)均为市售，使用前需灭菌。
[0023]实施例1
[0024]本发明提供一种快速富集与金黄色葡萄球菌结合上的CdTe量子点荧光的方法，具体操作方法如下:
[0025](1)称取26.6mg的二水醋酸镉，加入50mL去离子水，36.84mg的谷胱甘肽与醋酸镉溶液混合，调节pH至10.5 ;称取5.08mg的亚碲酸钾，加入50mL去离子水，将两种溶液混合，100°C回流lh，合成谷胱甘肽修饰的CdTe量子点，使用前，使用30kDa的超滤管浓缩20倍；
[0026](2)吸取100 μ 1 EDC (4mg/ml)加入200ul CdTe量子点中，活化30min，然后与分别与300ul金黄色葡萄球菌特有基因IsdA的兔抗抗体25°C共培养lh，连接，lOOkDa超滤管超滤，设置CdTe量子点空白对照组；
[0027](3)取lml对数期的金黄色葡萄球菌，离心，PBS洗涤，加入200 μ 1 CdTe量子点和抗体的复合物，33°C共培养lh，设置CdTe量子点及IsdA的兔抗抗体复合物空白对照；
[0028](4)将共培养的混合物吸入lml的无菌注射器中，用0.45um的滤膜过滤(实际操作组合如图3所示)，回收过滤液，然后更换针头，分别用PBS、PBST洗涤三次，紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则无，空白对照组经洗涤均无荧光。
[0029]为了更好地理解本发明提供的快速富集与金黄色葡萄球菌结合上的CdTe量子点荧光的方法的效果，对实验用量子点材料的光学特性进行表征，并对最终的结果进行了紫外检测。
[0030]图1为CdTe量子点的荧光特性。由图1可知，试验用CdTe量子点发黄色荧光，最佳发射波长为555nm，CdTe量子点的发射峰对称且窄，同时(MTe量子点的焚光强度可达到28000左右，保证的续实验的信号强度。
[0031]图3为金黄色葡萄球菌富集后的紫外检测结果图。从左往右依次为量子点空白组、CdTe量子点及IsdA的兔抗抗体复合物空白组、300ul抗体组。由此可以看出该富集检测方法可行，结果中量子点荧光有差别，可能是量子点浓缩的影响。
[0032]以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:将量子点荧光与金黄色葡萄球菌抗体偶联快速富集目标菌，利用荧光判别目标菌是否存在。2.根据权利要求1所述一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)以谷胱甘肽为稳定剂开放体系合成CdTe量子点； (2)EDC活化CdTe量子点的羧基，与金黄色葡萄球菌特有蛋白IsdA的兔抗体在20-25°C共同培养l_4h，超滤； (3)取lml对数期的金黄色葡萄球菌，离心，PBS洗涤，加入步骤(2)得到的CdTe量子点和抗体的复合物，30-33°C共同培养l_4h，同时取lml对数期的金黄色葡萄球菌，离心，PBS洗涤；不加入步骤⑵得到的CdTe量子点和抗体的复合物，30-33°C培养l_4h，作为空白对昭.(4)将步骤(3)的共培养混合物吸入lml的无菌注射器中，用0.45 μ m的滤膜过滤，回收过滤液，然后更换注射器，用PBS洗涤3-5次，然后用PBST洗涤3-5次，洗涤后的剩余物在紫外下观察是否有荧光，若有荧光则说明有金黄色葡萄球菌，反之则没有金黄色葡萄球菌。3.根据权利要求2所述的一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于:步骤(4)中将0.45 μ m滤膜与无菌注射器组合应用。
【专利摘要】本发明提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌的方法，将量子点荧光与金黄色葡萄球菌抗体偶联快速富集目标菌，利用荧光判别目标菌是否存在。本发明还公开了制备步骤。本发明优点是：本法采用量子点荧光作为检测信号，并用无菌注射器和滤膜组合进行信号富集，借助紫外进行检测，此法快速，简便，准确。首先CdTe量子点具有非常稳定的光学特性，这就保证了最终检测信号的稳定性；其次，抗体的特异性以及专一性决定了实验的准确性，最后，仅用注射器和滤膜即可进行富集，快捷，简单。本法可衍生应用于其它微生物检测，相对于国标检测的方法，本法更为快速，简便，具有良好的应用前景。
【IPC分类】G01N21/64, G01N33/569
【公开号】CN105424930
【申请号】CN201510822460
【发明人】王俊平, 王硕, 李真珍, 杜欣军
【申请人】天津科技大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年11月23日