【附图说明】
[0014]图1为实施例1不同互补的靶序列存在下的改良Taqman探针的熔解曲线。图1a和Ib表明改良Taqman探针随着温度变化对应的不同荧光通道变化情况；在图1a中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为焚光强度Fluoresecence采集HEX通道焚光；曲线I加入的为代表具核梭杆菌互补的靶序列，曲线2加入的为代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列，曲线3加入的为代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列，曲线6加没有加入任何靶。在图1b中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为焚光强度Fluoresecence采集FAM通道荧光；曲线4加入的为代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列，曲线5加入的为代表变形链球菌互补的靶序列。
[0015]图2为实施例1为不同互补的靶序列存在下的经过仪器分析处理后的改良Taqman探针的熔解曲线图。图2a和2b是通过将图1的温度与荧光强度的变化求导并取其负导数(-dF/dT)而得到，直接反应了在不同靶序列存在情况下改良Taqman探针的熔点；在图2中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT在图2a中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为焚光强度Fluoresecence采集HEX通道荧光；曲线I加入的为代表具核梭杆菌互补的靶序列，曲线2加入的为代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列，曲线3加入的为代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列，曲线6没有加入任何革巴。在图2b中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为焚光强度Fluoresecence采集FAM通道荧光；曲线4加入的为代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列，曲线5加入的为代表变形链球菌互补的靶序列。
[0016]图3a和3b为实施例2的熔解曲线检测分析图；在图3a中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；峰I代表具核梭杆菌互补的靶序列熔点，峰2代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列熔点，峰3代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列熔点。在图3b中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集FAM通道荧光；峰4代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列熔点，峰5代表变形链球菌互补的靶序列熔点。图3a和3b分别由3个平行管组成。
[0017]图4为实施例3的扩增曲线检测分析图；在图4中，横坐标为反应循环数Cycle，纵坐标为焚光强度Fluoresecence，采集HEX通道焚光；曲线I加入的为浓度106 copies的含有具核梭杆菌互补的革E序列质粒标准品，曲线2加入的为浓度105 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线3加入的为浓度104 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线4加入的为浓度103 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线5加入的为浓度102 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线6加入的为浓度101 copies的含有具核梭杆菌互补的革El序列质粒标准品，曲线7加入的为浓度100 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线8没有加入任何靶。
[0018]图5为实施例3的扩增曲线检测分析图；熔解曲线检测分析图；在图5中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；峰I加入的为浓度106 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰2加入的为浓度105 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰3加入的为浓度104copies的含有具核梭杆菌互补的革E序列质粒标准品，峰4加入的为浓度103 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰5加入为浓度102 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰6加入的为浓度101 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品。峰7加入为浓度100 copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰8没有加入任何靶。
[0019]图6和7为实施例4的熔解曲线检测分析图；在图6中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集FAM通道荧光；图6为金黄色葡萄球菌互补的革序列恪解曲线检测分析图；峰1为加入Fast Taq Polymerase，峰2为加入普通Taq Polymerase。在图7中，横坐标为温度Temperature (°C )，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；图7为具核梭杆菌互补的靶序列(峰3和峰4)和幽门螺旋杆菌(峰5和峰6)互补的靶序列熔解曲线检测分析图；峰3和峰5为加入Fast Taq Polymerase，峰 4 和峰 6 为加入普通 Taq Polymerase0
【具体实施方式】
[0020]以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的对突变进行检测，这些并不脱离本发明描述的基本概念。
[0021]实施例1考察人工合成不同的互补靶序列考察改良Taqman探针熔解曲线法分别检测五种口腔致病菌:牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的能力；
本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针，人以上五种口腔致病菌的靶序列，改良Taqman探针熔解曲线法检测五种口腔致病菌。所用的改良Taqman探针和靶的序列为:
牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2_3’
幽门螺旋杆菌的探针为 5’ -HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2_3’
具核梭杆菌的探针为 5’ -HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2_3’
变形链球菌的探针为 5’ -FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2_3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’ -FAM-cactttagaattagtg-BHQ2_3’
牙銀卟啉单胞菌互补革E的序列为5’ -Catctgtggtatgtggtgatg-3’
幽门螺旋杆菌互补革E的序列为5’ -Ctgctaatggtcacgttgcag-3’
具核梭杆菌互补革E的序列为5’ -Aaaatgaatatgtaaagtatgctatttt-3’
变形链球菌互补革E的序列为5’ -ttggaagagcacgtccaa-3’
金黄色葡萄球菌互补革E的序列为5’ -Cactaattctaaagtg-3’
所用的靶序列和探针都在上海生工生物工程有限公司合成。
[0022]20 μ L 反应液中含 10Χ PCR buffer 2 μ L(含 1.5 mM Mg2+)，10 pmol probemix，不加革El序列或者加入10 pmol上述革El序列中的一种。对上述混合液进行恪解曲线分析，反应条件为:95°C变性lmin，40°C保温2min，随后按1°C /step的升温速率从40°C递增至80°C进行熔解曲线分析，并且采集FAM和HEX荧光信号。该实验在Rotor-gene Q实时PCR仪上进行。
[0023]结果见图la，b和2a，b可以观察到，在没有靶序列存在时，改良Taqman探针低温时，自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发出荧光，随着温度的升高，改良分子信标的茎环结构逐渐解链而使荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光。在有靶序列存在的情况下，改良Taqman探针低温时与互补的靶序列形成刚性且稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降。对不同的靶序列，形成稳定性不同的双链杂合体，具有各自不同的熔点。不同的改良Taqman探针与不同的靶序列，在不同荧光通道形成各种独特的熔点。根据熔点的不同就很容易判断到底是加入的是哪种靶。因此，Taqman探针熔解曲线法可以用于五种口腔致病菌的检测。
[0024]实施例2考察多重PCR后人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在同时检测五种口腔致病菌(牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌)的能力。
[0025]本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，采用针对以上五种口腔致病菌全基因组DNA，考察改良Taqman探针熔解曲线法同时检测五种口腔致病菌的能力。所用的改良Taqman探针为:
牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2_3’
幽门螺旋杆菌的探针为 5’ -HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2_3’
具核梭杆菌的探针为 5’ -HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2_3’
变形链球菌的探针为 5’ -FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2_3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’ -FAM-cactttagaattagtg-BHQ2_3’
所用的引物为:
牙銀卟啉单胞菌的上