-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’ -ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’ 变形链球菌的下游引物为5’ -tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’ -agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
[0039]所用的探针、引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
[0040]含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本由口腔医院提供。
[0041]20 μ L 反应液中含 1X PCR buffer 2 yL(含 1.5 mM Mg2+)，1.8 mM MgCl 2, 7 mMdNTP, 10 pmol probe mix, 10 pmol引物mix，含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本，对上述混合液分别加入Fast Taq Polymerase和普通Taq Polymerase后进行PCR扩增，反应条件为:95°C预变性3min ;95°C变性5 sec，60°C保温3sec，72°C保温10 sec，45循环；在反应后混合物进行熔解曲线分析，反应条件为:95°C变性lmin，40°C保温2min，随后按1°C/step的升温速率从40°C递增至80°C进行熔解曲线分析，并且采集HEX和FAM荧光信号。该实验在Rotor-gene Q实时PCR仪上进行。
[0042]结果见图6和7，可以观察至I」，在有普通Taq Polymerase或者Fast TaqPolymerase反应液中，改良Taqman探针能够在FAM和HEX通道与对应的三种口腔致病菌(具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌)形成独特一致的熔点。特别是在有FastTaq Polymerase反应液中，改良Taqman探针能够在FAM和HEX通道与对应的三种口腔致病菌(具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌)形成独特一致的熔点并且熔点信号显著高于有普通Taq Polymerase的反应液，因此，采用Fast Taq Polymerase进行多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法检测临床口腔样本具有较好的检测效果。
【主权项】
1.一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测，具体包括以下三个步骤: 1)在需要检测五种口腔致病菌特异靶序列的区域分别设计并制备五条改良的Taqman探针； 2)在每一个设计好的改良Taqman探针外围分别设计一对引物，包括一条上游引物和下游引物，用该对引物对特异靶序列进行单重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应； 3)实时荧光PCR扩增反应后进行熔解曲线分析，根据改良Taqman探针熔点的变化来判断待检测核酸序列是否存在以上五种口腔致病菌及其类型。2.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:在步骤2)中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为单重单色PCR反应缓冲液，所述单重单色PCR反应缓冲液成分如下: Mgcl21 — 10 mM dNTP0.05 — 1.5 mM 引物混合物0.05 — 2 μ Μ 探针混合物0.05 — 2 μ Μ Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 模板 DNA1 — 20 ul 总体积10_100 ul o3.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:在步骤2)中，所述PCR扩增的多重多色反应体系为多重多色PCR反应缓冲液，所述多重多色PCR反应缓冲液成分如下: Mgcl21 — 10 mM dNTP0.05 — 1.5 mM 引物混合物0.05 — 2 μ Μ Fast Taq Polymerase 0.1 — 5 U 探针混合物0.05 — 2 μ Μ 模板 DNA1 — 20 ul 总体积10_100 ul o4.根据权利要求2或3所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述引物混合物成分如下: 牙銀卟啉单胞菌的上游引物为5’ -gtcgtttacgagcagccttc-3’ 牙銀卟啉单胞菌的下游引物为5’ -tttggcttccgttctattgg-3’ 幽门螺旋杆菌的上游引物为5’ -ggaaaccgattgccttcata-3’ 幽门螺旋杆菌的下游引物为5’ -tgatgaacagcaccagaagc-3’ 具核梭杆菌的上游引物为5’ -ccagctggcattcccttt-3’ 具核梭杆菌的下游引物为5’ -ttttatcggttggaggcaag-3’ 变形链球菌的上游引物为5’ -ctaaggattccaggggaagg-3’ 变形链球菌的下游引物为5’ -tggtggcacagaactaagca-3’ 金黄色葡萄球菌的上游引物为5’ -gctcacatgcctgtggacta-3’ 金黄色葡萄球菌的下游引物为5’ -agagccttgctgtgggatta-3’， 所述引物混合物中，每一个引物其5’端均增加一段共同的核酸序列CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，其作用在于提高PCR的灵敏度，特异性，减少引物二聚体的产生(Brownie J , et al.Nucleic acids research, 1997, 25(16): 3235-3241.)，更为重要的是提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被Taq Polymerase切割，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。5.根据权利要求2或3所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述探针混合物成分如下: 牙銀卩卜啉单胞菌的探针为5’ -catcaccacataccacagatg-3’ 幽门螺旋杆菌的探针为5’ -ctgcaacgtgaccattagcag-3’ 具核梭杆菌的探针为 5’ -aaaatagcatactttacatattcatttt-3’ 变形链球菌的探针为5’ -ttggaagagcacgtccaa-3’ 金黄色葡萄球菌的探针为5’ -cactttagaattagtg-3’。6.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述改良Taqman探针是一种在低温状态下会形成颈环结构的荧光探针，长度为16-28个碱基，除环上的序列与靶互补外，其臂上碱基也与靶互补。7.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述改良Taqman探针在5’末端标记荧光基团或淬灭基团，在没有与把序列杂交时，改良Taqman探针自身形成颈环结构，使荧光基团和淬灭基团相互靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在与把序列杂交时，改良Taqman探针颈环结构解离，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收。8.根据权利要求7所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CAL Gold 540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL FluorRed 590，ROX，CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar670, CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705 等。9.根据权利要求7所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于:所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE 等。
【专利摘要】本发明公开了一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测；采用多重PCR检测操作简单、检测周期短，不会出现假阳性，同时还无需开管操作，可重复使用，节约了资源节省了成本，检测灵敏性特异性高。
【IPC分类】C12R1/145, C12R1/46, C12Q1/04, C12Q1/14, C12R1/445, C12Q1/68, C12R1/01
【公开号】CN105256048
【申请号】CN201510748326
【发明人】刘旭宏
【申请人】厦门基科生物科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月6日