一种土壤类芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种土壤类芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

微生物胞外多糖因其特殊的流变性质，可作为增稠剂、悬浮剂或稳定剂，广泛应用于食品、化妆品等行业。具有典型流变特征的微生物胞外多糖如黄原胶(Xanthan gum)能够增加溶液的粘度，并且具有一定的耐温性能，适度增加温度后粘度基本保持稳定；结冷胶(Gelan gum)水溶液在Ca²⁺存在条件下能够形成不可逆的脆性凝胶；热凝胶(Curdlan gum)不溶于水，但其悬浮液加热至55℃后能够形成热可逆的弹性凝胶，加热至80℃后可以形成热不可逆的脆性凝胶；威兰胶(Welan gum)具有良好的耐热性质，具有作为石油开采用驱油剂的潜力。另一方面，相比于植物多糖和海洋藻类多糖，微生物胞外多糖具有不受气候影响、生产工艺简便、成本低、便于大量制备等优点(Williams P A,Phillips D L.Introduction to food hydrocolloids[M].WILLIAMS P A,PHILLIPS D L.Handbook of hydrocolloids.Woodhead publishing Ltd.2009.)。由此可见，性能优良的微生物胞外多糖对民生相关行业发展具有促进作用。

目前微生物胞外多糖在应用中存在一定的限制因素。比如，为增加黄原胶溶液粘度只能通过提高黄原胶的添加量而无法通过简单的后处理工艺实现；溶液中存在Ca²⁺或Mg²⁺限制了结冷胶的使用量；具有较高温度的热处理过程则会受到热凝胶的影响。因此，对传统微生物胞外多糖进行化学改性或发现新型微生物胞外多糖显得尤为必要。

研究发现，类芽孢杆菌属微生物具有产生新型胞外多糖的能力。土壤类芽孢杆菌最初发现时被归类为芽孢杆菌属，后被重新命名为土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus edaphicus)。土壤类芽孢杆菌具有促进植物生长的作用，其主要原因可能是因为该菌能够降解并固定土壤中难利用的钾，进而促进植物对钾的利用(Sheng X F.Growth promotion and increased potassium uptake of cotton and rape by a potassium releasing strain of Bacillus edaphicus[J].Soil Biology&Biochemistry,2005,37(10):1918-1922.)。除此之外，研究还发现土壤类芽孢杆菌能够产生厚的胞外荚膜(何琳燕等.一株硅酸盐细菌的鉴定及其系统发育学分析[J].微生物学报,2003,43(2):162-168.)。已经证实与土壤类芽孢杆菌亲缘关系非常近的胶质类芽孢杆菌同样具有产生荚膜的能力，并且该荚膜为胞外多糖，并具有较好的生物絮凝作用(Tang J Y,et al.Production,purification and application of polysaccharide-based bioflocculant by Paenibacillus mucilaginosus[J].Carbohydrate Polymers,2014,113:463-470.)。因此可以推测，土壤类芽孢杆菌具有产生新型胞外多糖的能力。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16，能够生产具有特殊流变性质的水溶性胞外多糖。

实现上述目的的技术方案为：

一种土壤类芽孢杆菌，为Paenibacillus edaphicus NUST16，保藏编号为CCTCC No.M2016542，已于2016年10月08日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。

本发明的目的之二在于提供上述土壤类芽孢杆菌NUST16的培养方法，具体步骤如下：将土壤类芽孢杆菌NUST16接种到灭菌后、pH为6.0-9.0的培养基中，25-35℃下培养。

本发明的目的之三在于提供上述土壤类芽孢杆菌在生产水溶性胞外多糖中的应用。

进一步地，本发明提供上述土壤类芽孢杆菌在生产水溶性胞外多糖的方法，具体步骤如下：

步骤1，将土壤类芽孢杆菌NUST16接种到灭菌后的培养基中，25-35℃摇床震荡培养形成种子培养液；

步骤2，按0.5％-20％接种量将种子培养液接种到灭菌后的培养基中，25-35℃摇床震荡培养，获得产胞外多糖的发酵液；

步骤3，在发酵液中加入沉淀剂A，发酵液中的沉淀经过滤或离心，干燥后即得固体粗多糖，所述的沉淀剂A为95％-100％乙醇、95％-100％甲醇、95％-100％异丙醇和95％-100％丙酮中的一种或者多种。

步骤1中，所述的培养时间为12-48h。

步骤2中，所述的培养时间为48-96h。

步骤3中，所述的沉淀剂A与发酵液的体积比为2～4:1，所述的沉淀剂A为95％-100％乙醇、95％-100％甲醇、95％-100％异丙醇和95％-100％丙酮中的两种以上溶剂按等体积混合而成的混合溶液。

本发明中，所述的培养基的组成为蔗糖5-50g/L，蛋白胨0.5-5g/L，NaH₂PO₄ 0.1-5.0g/L，CaCl₂ 0.01-0.5g/L，MgCl₂ 0.01-0.5g/L，KCl 0.01-0.5g/L，FeCl₂ 0.001-0.05g/L，CuSO₄ 0.001-0.05g/L，MnSO₄ 0.001-0.05g/L，ZnCl₂ 0.001-0.05g/L，CoCl₂ 0.001-0.05g/L，pH为6.0-9.0。

优选地，所述的培养基的pH为7.0-9.0。

更进一步地，上述土壤类芽孢杆菌在生产水溶性胞外多糖的方法，还包括如下步骤：

步骤4，将固体粗多糖溶于水中形成粗多糖溶液，加入处理液B并剧烈震荡，静置或离心分离有机相和水相，收集水相，并重新加入处理液B，重复3～10次，可得纯化多糖，所述的处理液B为三氯甲烷、苯酚和正丁醇的混合溶液。

步骤4中，所述的粗多糖溶液的浓度为0.25～20g/L，所述的粗多糖溶液与处理液B的体积比1:(1～2)。

步骤4中，所述的处理液B中，三氯甲烷、苯酚和正丁醇的体积比为1:(0.5～1):(0.05～0.5)。

本发明的土壤类芽孢杆菌菌株性质独特，能够生产胞外多糖，产量可达15g/L，所产的胞外多糖易于分离和纯化且性质独特，可直接溶于冷水，并且具有显著的增加溶液粘度的作用，能够耐受溶液中高浓度的Na⁺、K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺，经过简单的加热-冷却处理即可使溶液粘度数倍增加，且性质稳定，形成热可逆凝胶。

附图说明

图1是土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16菌株的平板菌落和显微形貌图。

图2是胞外多糖组分测定的高效液相色谱图。

图3是4种无机盐对胞外多糖粘度的影响结果图。

图4是重复加热-冷却处理对1g/L胞外多糖溶液粘度的影响结果图。

图5是重复加热-冷却处理对5g/L胞外多糖溶液粘度的影响结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。

实施例1

土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16的分离和鉴定。

(1)土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16的分离

本发明的土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16是在江苏盐城的滨海棕色土壤中分离得到。其中分离的方法为：

①菌株筛选：将土壤样品分为10组，各组分别称取1g土样加入到配制好的液体培养基中，放入恒温振荡培养箱中在200rpm，30℃条件下培养2d进行富集，然后从各组锥形瓶中取1mL菌液再次接入新的液体培养基中，相同条件下培养2d再富集一次。再从各组各取1mL富集后菌液加入到9mL无菌水中，混匀制成菌悬液，采用10倍梯度稀释，取10^-6-10^-4稀释度的菌悬液涂布于固体培养基中，30℃下培养。

②菌株纯化：涂布好的平板培养2d，待长出菌落后，根据菌落形态特征挑取单一菌落在新的固体培养基上划线，30℃下培养，待长出菌落后再挑选单一菌落划线，此过程重复3-4次，直到培养皿上长出的菌落均为单一形态的菌落使得菌株纯化完全。然后挑选具有无色透明或半透明、有粘性等产胞外多糖特征的菌落编号后，分别接种至液体培养基中，200rpm，30℃条件下培养2-4d，若发酵液变粘，则鉴定胞外发酵产物是否属于多糖。经鉴定后发酵产物为多糖的菌株则是需要的产胞外多糖菌株，命名为NUST16。

(2)菌株的鉴定

a.形态特征：在无机盐琼脂固体培养基上30℃培养本菌株2-3天后观察，菌落呈圆形，无色、半透明，表面有光泽，粘稠，不易挑起。菌株长棒杆状、分泌大量的胞外多糖。

b.生理生化特征：菌株革兰氏阳性，好氧，接触酶反应阳性，以葡萄糖为碳源发酵产酸，培养基中含有1％NaCl时生长良好。菌株可利用的碳源有蔗糖、淀粉、葡萄糖、乳糖，果糖利用能力弱，以乳糖为碳源时菌体生长最好，蔗糖次之，在有机氮源蛋白胨中生长好，在pH7-9的碱性条件下胞外多糖产量较高，发酵48h后胞外多糖产量可达到15g/L。高浓度NaCl会抑制菌株生长并降低胞外多糖产量，菌株不分泌色素。图1中，A为固体平板培养基上的菌落，B为菌体在光学显微镜下的照片。

c.以菌株NUST16的基因组DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，该菌株的16S rDNA基因序列见序列表。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登陆号为KX962167)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，菌株NUST16与土壤类芽孢杆菌AB045093的序列相似度高达99％。

根据菌株NUST16的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，该菌株NUST16鉴定为土壤类芽孢杆菌，命名为土壤类芽孢杆菌NUST16。

实施例2

土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培养及在生产水溶性胞外多糖中的应用。

配制培养基，蔗糖5g，蛋白胨0.5g，NaH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂ 0.01g，MgCl₂ 0.01g，KCl 0.01g，FeCl₂ 0.001g，CuSO₄ 0.001g，MnSO₄ 0.001g，ZnCl₂ 0.001g，CoCl₂ 0.001g溶于1L去离子水中，pH为6.0，加入1％营养琼脂121℃灭菌15min后冷却得到固体培养基。在琼脂固体培养基上30℃培养本菌株48h后可看到有菌落长出，菌落呈圆形，半透明，表面有光泽，粘稠，不易挑起，菌株分泌大量的胞外多糖。刮取每只9cm平板上的菌落用30mL去离子水溶解，然后经5000×g离心20min，上清中加入60mL乙醇-异丙醇混合液(体积比1:1)室温沉淀，经过滤收集沉淀并于40℃干燥后即得粗多糖。

图2为胞外多糖组成的高效液相色谱图，同一组分保留时间相同。其中图2A为10种标准单糖及其衍生物经PMP衍生化后在高效液相中的洗脱曲线；图2B为土壤类芽孢杆菌NUST16产胞外多糖经三氟乙酸完全水解后的水解产物经PMP衍生化在高效液相中的洗脱曲线，各洗脱峰之间不存在重叠。经过比较可以发现，D-甘露糖(D-Man)、D-葡萄糖醛酸(D-GlcUA)、D-葡萄糖(D-Glc)、D-半乳糖(D-Gal)和L-岩藻糖(L-Fuc)在A图和B图中保留时间完全一致。经定量计算可得土壤类芽孢杆菌NUST16产胞外多糖中D-葡萄糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖醛酸摩尔比为3:3:2:1:1，另一种表述为：Glc:Man:Fuc:Gal:GlcUA＝3:3:2:1:1。该多糖为杂多糖。

实施例3

土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培养及在生产水溶性胞外多糖中的应用。

配制培养基，蔗糖50g，蛋白胨5g，NaH₂PO₄ 5g，CaCl₂ 0.5g，MgCl₂ 0.5g，KCl 0.5g，FeCl₂ 0.05g，CuSO₄ 0.05g，MnSO₄ 0.05g，ZnCl₂ 0.05g，CoCl₂ 0.05g溶于1L去离子水中，pH为7.0，121℃灭菌20min后冷却备用，加入1％营养琼脂121℃灭菌15min后冷却得到相应固体培养基。挑取琼脂固体培养基上长出的土壤类芽孢杆菌NUST16单菌落至灭菌后的培养基中，25℃震荡培养24h形成种子培养液，再将7％的种子培养液加入到此备用培养基中35℃震荡培养48h，获得发酵液。向发酵液加入3.5倍体积的95％乙醇-丙酮混合液(体积比1:1)，室温振荡，然后经5000×g离心20min收集沉淀，50℃干燥后即得粗多糖10.08g。

实施例4

土壤类芽孢杆菌Paenibacillus edaphicus NUST16的培养及水溶性胞外多糖的生产和纯化。

配制培养基，蔗糖20g，蛋白胨3g，NaH₂PO₄ 3g，CaCl₂ 0.05g，MgCl₂ 0.15g，KCl 0.15g，FeCl₂ 0.03g，CuSO₄ 0.003g，MnSO₄ 0.05g，ZnCl₂ 0.005g，CoCl₂ 0.01g溶于1L去离子水中，pH为9.0，121℃灭菌20min后冷却备用；挑取固体培养基上长出的土壤类芽孢杆菌NUST16单菌落至灭菌后的培养基中，35℃震荡培养36h形成种子培养液，再将5％的种子培养液加入到灭菌后的培养基中32℃震荡培养72h，获得发酵液。向发酵液加入3倍体积的95％乙醇-100％甲醇-异丙醇混合液(体积比1:1:1)，沉淀并过滤，45℃干燥后即得粗多糖14.83g。将粗多糖10g重新溶于去离子水中至终浓度15g/L，然后加入1.1倍体积的氯仿-苯酚-正丁醇混合液(体积比1:0.85:0.15)振荡然后静置分层，收集水相重新加入上述混合液，重复操作5次，可以得到去蛋白的胞外多糖。所得的去蛋白多糖用30倍体积的去离子水经截留分子量3000Da半透膜透析48h，然后向透析后的多糖中加入4倍体积95％乙醇-丙酮混合液(体积比1:1)，经沉淀并过滤后，50℃干燥可得纯化的胞外多糖6.47g。

实施例5

土壤类芽孢杆菌NUST16产生的胞外多糖在调节水溶液流变性质中的应用。

按实施例4制备纯化的胞外多糖，然后室温下，用去离子水溶解该多糖至终浓度为6.5g/L，经测定溶液粘度为3755mPa.s，记为初始粘度。依次配制浓度分别为20g/L KCl、40g/L NaCl、80g/L MgCl₂和100g/L CaCl₂溶液，室温条件下用4种溶液分别溶解胞外多糖至终浓度6.5g/L并测定粘度，粘度依次为3525mPa.s，3645mPa.s，3042mPa.s和3160mPa.s，粘度均超过初始粘度的80％。此外，配制混合无机盐溶液，其中KCl、NaCl、MgCl₂和CaCl₂浓度均为25g/L，室温下溶解胞外多糖至终浓度6.5g/L，测定粘度值为3055mPa.s，为初始浓度的81.4％。

图3为室温条件下向溶液中分别添加不同浓度的NaCl、KCl、CaCl₂和MgCl₂时胞外多糖溶液粘度变化情况。可以看出，当盐浓度高达100g/L时多糖溶液粘度仍然能够保持初始粘度的80％以上，并且Ca²⁺和Mg²⁺不会使溶液形成凝胶，这对高盐条件下的单元操作有极大帮助。可知，土壤类芽孢杆菌NUST16产生的胞外多糖在调节水溶液流变性质上具有较好作用，特别是当溶液中含有高浓度盐离子时，仍能够显著增加溶液粘度并保持稳定。

实施例6

土壤类芽孢杆菌NUST16产生的胞外多糖在调节水溶液流变性质中的应用。

按实施例4制备纯化的固体胞外多糖，室温下用去离子水溶解胞外多糖至终浓度5g/L，并测定粘度为2760mPa.s，并记为初始粘度。取500mL多糖溶液置于沸水浴中10min，然后迅速取出并冷却至室温(25℃)，冷却后多糖溶液具有流动性，未形成凝胶，经测量粘度为19640mPa.s，为初始粘度的7.08倍。将该溶液重新置于沸水浴中10min溶液粘度下降，然后冷却至室温测定粘度为20100mPa.s，继续重复3次，所观察到的现象一致，粘度依次为19950mPa.s，19970mPa.s和20550mPa.s。经5次加热-冷却循环操作，多糖溶液粘度保持稳定，溶液澄清透明，无颜色变化，并且始终未形成热不可逆凝胶。

图4为1g/L的胞外多糖溶液经95℃热处理10min后冷却至室温的粘度变化情况。可以看出，经简单的热处理后，溶液粘度由235mPa.s提高至850mPa.s,粘度为处理前的3.62倍。经过5次重复操作后，粘度保持稳定。图5为5g/L的胞外多糖溶液经100℃热处理10min后冷却至室温的粘度变化情况。可以看出，经简单的热处理后，溶液粘度由2760mPa.s提高至19640mPa.s，粘度为处理前的7.08倍。经过5次重复操作后，粘度仍然保持稳定。这一特性可极大地降低多糖使用量，或者降低前处理时的单元操作难度。可知，土壤类芽孢杆菌NUST16产生的胞外多糖加入到溶液中，通过简单的加热-冷却操作能进一步成倍的提高溶液粘度，并且经过多次重复粘度保持稳定，不会形成热不可逆凝胶，说明该胞外多糖性质稳定，具有较为广泛的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京理工大学

<120> 一种土壤类芽孢杆菌及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> Paenibacillus edaphicus

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