一株胶质类芽孢杆菌n6及其应用
【专利摘要】本发明公开了一株胶质类芽孢杆菌N6及其应用。该菌株的分类命名为胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)N6，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2015548。本发明胶质类芽孢杆菌N6可以在硅酸盐细菌培养基平板培养条件下生长，并能够把矿物中的钾解离出来。在液体振荡培养条件下，通过火焰分光光度计析速效钾增量发现与对照相比，增量显著。本发明的胶质类芽孢杆菌N6接种玉米后，通过盆钵实验，能够明显促进玉米的生长发育；同时在果园中的实验表明，施用N6发酵液能够明显促进苹果的着色率。因此本发明为提高玉米生长和苹果质量提供了优良的菌株资源。CCTCC NO：M201554820150916
【专利说明】
一株胶质类芽孢杆菌N6及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物肥料技术领域，具体涉及一种胶质类芽孢杆菌N6及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物生长需要大量的氮、磷、钾等化学元素，其中，钾素的重要性常常被农民所忽 视:几十年来，我国在农业生产中一直存在着"重施氮肥磷肥，少施或不施钾肥"的现象。实 际上，钾不仅是一些重要粮食作物生长发育所必需的（例如水稻对钾肥的需求甚至超过于 氮肥和磷肥）；而且也是一系列经济作物，例如棉花、茶叶、烟草、西瓜、香蕉等所需要的大量 元素。植物在缺钾的情况下，产量低下、抗逆性差，且极易发生倒伏。
[0003] 农作物所需要的钾素，目前仍主要靠化学钾肥提供，但是全球钾矿资源分布极不 均衡，化学钾肥生产在地域和生产厂商方面均具有极高的集中度，而我国钾矿资源贫乏，钾 肥制造企业产能偏小，造成我国目前70 %的化学钾肥依赖于进口，钾肥供应严重依赖于国 际市场，钾肥国内价格长期受制于国际市场，缺乏议价能力。所以，由于钾肥价格偏高，对钾 肥重要性的忽视，加之农作物产量水平的不断提高以及复种水平的逐步增加的因素的叠加 应影响，目前我国农田缺钾现象日益严重，缺钾的土壤面积不断扩大，土壤"缺钾"的状况已 直接影响到我国农业生产能力的进一步提升。
[0004] 实际上，土壤中的钾素是非常丰富的，所谓"缺钾"，缺少的只不过是植物能够利用 的有效钾。钾长石和云母等硅酸盐矿物，是组成地球表面岩石和土壤的主要成分（占60%以 上），地壳中钾含量占2.35 %，在所有元素中占第7位，其中土壤含钾量占1.16 %，而土壤中 95 %的钾存在于钾长石、云母这两大矿物中。土壤钾主要以矿物、固定钾、代换钾和水溶钾4 种形态存在，其中只有2%的代换钾和水溶性钾可被植物吸收利用。
[0005] 土壤中存在着一些能够分解土壤硅酸盐类矿物的微生物，可以释放其中土壤中 钾、磷、硅等元素，从而为植物生长提供相应营养。根据我国微生物肥料的农业行业标准 (NY882-2004)，可开发为解钾细菌肥料的菌种至少有两种：胶质类芽孢杆菌 (Paenibacillus mucilaginosus)和土壤类芽抱杆菌（Paenibacillus ed aphicus)。胶质 类芽孢杆菌是土壤中一类特殊的革兰氏阴性芽孢杆菌，能分解硅酸盐和铝硅酸盐组成的岩 石矿物，具有溶磷、解钾及固氮能力，尤其能将土壤中的无效钾转变为速效钾，供植物吸收 利用。因此土壤中分离开发具有高效解钾能力的细菌，大量发酵之后并将之应用土壤，活化 土壤中难溶性钾，提高农作物产量和质量，具有重要的经济意义，并有利于农业的可持续发 展。
[0006] 玉米属于禾本科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)玉蜀黍属玉米种，又称棒子或者荀 谷。它的原产地是北美洲的墨西哥和南美洲的秘鲁。后来哥伦布发现了美洲新大陆将玉米 引种到了欧洲，一段时间以后玉米被传播到了时间各地并成为了主要的粮食作物之一。玉 米植株比较高大，茎挺直，玉米叶于茎两侧互生，叶窄而长边缘波状。玉米是雌雄同体植物， 雄花顶生，雌花腋生。雌花成熟后形成谷穗且具有粗大中轴，籽粒呈纵列分布。谷穗外有多 层变态叶包裹，这些变态叶叫做包皮。玉米籽粒可食，二倍体玉米植株的体细胞中染色体数 目为10对，所以玉米的列数一般为偶数列。根据籽粒质地的商业等级划分，玉米籽粒可分 为:硬质种、粉质种、爆裂种、马齿种和糯玉米等。籽粒硬淀粉和软淀粉的干燥度不相等形成 了籽粒的顶部凹陷。硬粒玉米含软淀粉较少，干燥后籽粒顶端不凹陷;粉质玉米含软淀粉较 多，质地粉质，容易碾碎;爆裂玉米是硬玉米的极端型，籽粒小而硬，不含软淀粉，加热时细 胞内受热膨胀，籽粒爆裂。玉米可以用作饲料、食物和工业原料。
[0007]苹果树(Malus domestica)是蔷薇科的落叶树种，而苹果是蔷薇科中非常甜的果 实。苹果树是世界性的栽培果树，它起源于中亚地区，在亚洲和欧洲已经有了上千年的发展 历史。苹果树一般的栽培品种，高度可以达到1.8米一4.6米，一些品种可以达到12米高。通 过砧木筛选和人工修剪能使苹果树形成不同的大小，形状和树枝密度。苹果树叶子是深绿 色，椭圆形，有锯齿状边缘，叶在树枝上是简单的交替排列。叶柄粗壮长度约1.5-3厘米且有 短柔毛;托叶质地为草质，呈披针形，顶端为渐尖形有浓密的短柔毛。苹果树花序为伞房花 序，由3-7多花组成且着生于小枝的顶端;苞片质地为膜质，苞片形状为线状披针形，先端渐 尖且有绒毛;苹果幼苗花直径3-4厘米，萼筒外面有密集的绒毛;苹果幼苗花的花瓣呈倒卵 形长15-18毫米基部具短爪，花瓣白色，未开放时是粉红色;苹果幼苗花期是4-5月，果实成 熟为7-10月。成熟的苹果甜美可口，是世界上产量最大的水果之一。
【发明内容】
[0008] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一株胶质类芽孢杆 菌N6,具有具有高效解钾能力。本发明的另一目的是提供上述一株胶质类芽孢杆菌N6的应 用。
[0009] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[00?0] -株胶质类芽孢杆菌，其分类命名为胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucila ginosus)N6,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC Ν0:Μ 2015548;保藏时间 2015.09.16，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0011]所述的胶质类芽孢杆菌N6在促进玉米生长中的应用。
[0012] 所述的胶质类芽孢杆菌N6在提高苹果质量中的应用。
[0013] 所述的胶质类芽孢杆菌N6在解钾中的应用。
[0014] 所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在促进玉米生长中的应用。
[0015] 所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在提高苹果质量中的应用。
[0016] 所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在解钾中的应用。
[0017] 该胶质类芽孢杆菌N6从南京菜园土中分离，主要生物学特征：如图1所示，菌落均 呈无色、半透明，明显隆起，边缘整齐，表面光滑，富有弹性且易拉成丝。菌体革兰氏染色呈 阴性，杆状或短杆状，荚膜肥厚。该菌株在常见的牛肉膏蛋白胨培养基上不生长。过氧化氢 酶活性测试呈阳性，柠檬酸盐利用试验测试呈阴性，葡萄糖发酵试验测试呈阳性，甲基红试 验测试呈阳性，淀粉水解试验测试呈阳性，耐盐性（1 %)测试呈阴性。
[0018] 该胶质类芽孢杆菌N6菌株16S rRNA基因序列，如SEQ ID N0.1所示。采用BLAST (http:/www.ncbi .nlm.nih.gov)将菌株16S rRNA基因序列与GenBank中序列进行比对，并 选择代表性的模式种构建系统发育树。根据菌株N6的16S rRNA基因同源性并结合其系统发 育树，以及生理生化特征，可将菌株N6鉴定为胶质类芽孢杆菌Paenibacillus mucilagenosus N6〇
[0019] 有益效果：与现有技术相比，本发明胶质类芽孢杆菌N6可以在硅酸盐细菌培养基 平板培养条件下生长，并能够把矿物中的钾解离出来。在液体振荡培养条件下，通过火焰 分光光度计析速效钾增量发现与对照相比，增量显著。本发明的胶质类芽孢杆菌N6接种玉 米后，通过盆钵实验，能够明显促进玉米的生长发育；同时在果园中的实验表明，施用N6发 酵液能够明显促进苹果的着色率。因此本发明为提高玉米生长和苹果质量提供了优良的菌 株资源。
【附图说明】
[0020] 图1是胶质类芽孢杆菌N6的菌落形态图；
[0021]图2是胶质类芽孢杆菌N6液体解钾能力测定结果图；
[0022]图3是胶质类芽孢杆菌N6荚膜染色结果图。
【具体实施方式】
[0023]根据下述实施例，可以使本领域技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅 用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0024]实施例1:胶质类芽孢杆菌N6的培养。
[0025]硅酸盐细菌培养基：蔗糖 5g，Na2HP04 2g，MgS04 · 7H20 0.5g，FeC13 0.005g， 〇&(：03 0.18，土壤矿物*1.(^，琼脂15~2(^，水10001111，？!170~7.5
[0026] 土壤矿物：去除有机残体之土壤，加6N HC1煮沸半小时，过滤，用蒸馏水淋洗至无 氯离子反应。或者采用钾长石粉l.Og。
[0027] 培养基灭菌，待温度降到60 °C左右，加入煮沸处理过的lg 土壤矿物或者盐酸洗涤 过的钾长石粉，混匀，倒平板。胶质类芽孢杆菌N6即可在硅酸盐固体培养基上生长。
[0028]实施例2:胶质类芽孢杆菌N6液体解钾能力测定
[0029]液体解钾试验培养基：蔗糖 10.0g，Na2HP〇4 2.0g，MgS〇4 · 7H20 0.5g，（NH4)2S〇4 1.0g，NaCl 0.1g，CaC03 l.Og，酵母膏0.5g，钾长石粉lO.Og，水 1000mL，pH 7.2。
[0030] 钾长石研磨，过100目筛，水洗去水溶性钾，阴干。250mL三角瓶分装上述培养基 50mL，加入1.0g土壤矿物（100目），121°C灭菌30min，接入2个直径接近lcm的菌落。对照不接 菌，试验设5个重复。28 °C振荡培养5d后用火焰光度计分析速效钾增量，结果如图2所示。
[0031] 从图2结果可以看出，加入胶质类芽孢杆菌N6的液体培养基中，速效钾增量比对照 增加超过80%，效果极显著(p〈0.01)。该结果表明胶质类芽孢杆菌N6对土壤矿物和钾长石 有较强的解钾能力。
[0032]实施例3:胶质类芽孢杆菌N6荚膜染色
[0033]材料:胶质类芽孢杆菌N6,荚膜染色液，载玻片，纯甲醇，黑色碳素墨水，无菌水。 [0034]步骤:在载玻片上滴一滴无菌水，取少许培养了72小时的胶质类芽孢杆菌N6在水 中制成悬液，取一滴配好的黑色碳素墨水与菌悬液混合，另取一片载玻片作为推片，将推片 一端平整的边缘于悬液以30度角接触后，顺势将悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。 用纯甲醇固定1分钟，加番茄红液滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染色30秒，以细水流适当冲 洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色，如图3所示。
[0035]实施例4:胶质类芽孢杆菌N6温室盆栽试验。
[0036]将采集来的自然土样风干，过8目筛，装入试验用塑料钵，每钵装土500g。将"登海9 号"玉米种子用10%次氯酸钠溶液消毒，清洗后于28°c恒温培养基箱中培养48h，待生根生 芽之后，将玉米幼根进行N6菌落的蘸根处理，然后播种。处理和对照各自均为40钵，每钵播6 粒玉米种子，一周后间苗，每钵留4株。隔天进行浇水管理，其他管理条件一致。培养25后调 查玉米株高、干重。
[0037]胶质类芽孢杆菌N6接种25d后对玉米生长的影响见表1。从中可以看出，接种胶质 类芽孢杆菌N6发酵液明显促进了玉米的生长。玉米根长、株高与CK相比均有不同程度的增 长。
[0038]表1接种胶质类芽孢杆菌N6对玉米幼苗生长的影响
[0040]实施例5:胶质类芽孢杆菌N6促进苹果幼苗生长
[0041 ] 按以下配方配制培养基（淀粉10g，酵母膏0.4g，K2HP〇4 0.5g，CaC03 lg，MgS〇4 · 7H20 0 · 2g，FeCl3 0 · 005g，蒸馏水1000mL，pH7 ·0-7 · 2)，从固体平板上刮取约培养基2%体积 的N6菌落，无菌操作接入上述培养基中，30 °C培养3天，在培养液中加入10倍体积生理盐水 备用。选择苹果初花期选择长势基本一致的富士品种树进行试验。设胶质类芽孢杆菌N6培 养液2000mL/株、4000mL/株、及对照共3个处理，分别进行根部施肥，围绕树下约20cm，开6 条放射状沟渠，将培养液或者空白培养基用5kg水稀释后灌入。采用随机小区实验方式，每 种处理3株小区，重复3次。果实成熟时着重考查果实着色情况、含糖量。果园其它管理措施 均与常规保持一致。
[0042] 结果如表2所示，表明施用胶质类芽孢杆菌N6之后，果实含糖量增加大约1.5-2.2%。苹果着色期比对照早约7-10天，着色率增加超过一倍，可见，胶质类芽孢杆菌N6培养 液对苹果叶片的生长、果实的发育及着色都有明显的促进作用。
[0043] 表2:接种胶质类芽孢杆菌N6对苹果质量的影响
【主权项】
1. 一株胶质类芽孢杆菌，其分类命名为胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginosus)N6,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2015548;保藏 时间2015.09.16，保藏地址为中国武汉武汉大学。2. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6在促进玉米生长中的应用。3. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6在提高苹果质量中的应用。4. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6在解钾中的应用。5. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在促进玉米生长中的应用。6. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在提高苹果质量中的应用。7. 权利要求1所述的胶质类芽孢杆菌N6培养物在解钾中的应用。8. -种制备胶质类芽孢杆菌N6培养物的方法，其特征在于:配制培养基:淀粉IOg，酵母 膏0.4g，K2HP〇4 0.5g，CaC03 lg，MgS〇4,7H20 0.2g，FeCl3 0.005g，蒸馏水 1000mL，pH7.0-7.2;从固体平板上刮取培养基2 %体积的N6菌落，无菌操作接入上述培养基中，30 °C培养3 天，在培养液中加入10倍体积生理盐水，获得胶质类芽孢杆菌N6培养物。
【文档编号】C12R1/07GK105950505SQ201610341875
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】樊奔, 夏永仙, 杨磊, 陈晟, 李昱龙
【申请人】南京林业大学