专利名称：一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法
技术领域：
本发明涉及微生物含量测定的方法，具体涉及一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法。
背景技术：
芽孢杆菌制剂是一种无毒副作用、无药物残留的绿色产品，其产品中含有的活菌是以内生孢子的形式存在，是畜禽水产养殖中常用的饲料添加剂和水质改良剂。然而，缺少质量标准是芽孢杆菌制剂在开发研制中存在的主要问题之一，而导致质量标准缺乏的最大的问题之一就是活菌数与标签不符，有些甚至难以检测到活菌。因此，稳定可靠的芽孢杆菌制剂的计数方法无疑对芽孢杆菌制剂正常生产及其质量控制具有重要的意义。目前，显微镜直接计数法、平板菌落计数法等芽孢杆菌制剂的传统计数方法由于存在一些缺陷，使计数结果不稳定。例如，显微镜直接计数法无法区分死菌体和活菌体，计数结果是死菌体和活菌体的总和；平板菌落计数法操作繁杂，而且计数结果易受多种因素的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法。本发明提供的一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法，包括如下步骤1)样品的制备无菌操作随机称取复合芽孢杆菌粉lg，加入盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成1 10的稀释母液，设3个平行样；2)样品的稀释取3个平行样，分别进行如下处理无菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀释母液，加入盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成 1 IO2的稀释液，这样依次稀释，分别得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13稀释度的稀释液，每次稀释时必须更换ImL玻璃移液管；3)培养将 1 10 的稀释母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀释液置于转速为 200r/ min、温度为35 37°C的温控摇床中，培养18_24h ；以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照；4)测定以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，无菌操作用ImL 玻璃移液管吸取0. ImL培养18-24h变浑浊的各稀释液采用khaeffer-Fulton氏染色法进行芽孢染色，显微镜观察有无绿色的芽孢；显微镜观察有绿色芽孢、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为复合芽孢杆菌粉的活菌含量(cfu/g)。本发明可快速、准确，直接观察测定出复合芽孢杆菌粉的活菌含量。其原理是将待测样品经过适当稀释之后，其中的芽孢杆菌充分分散成单个细胞，然后在无菌营养肉汤中通过孵育培养而生长繁殖，从而形成肉眼可见的浑浊液，再进一步通过芽孢染色确定最大稀释度浑浊液中含有大量的芽孢，最后确定待测样品的活菌总数。它与显微镜直接计数法相比因能够区分死菌体和活菌体而使活菌总数的测定结果更准确，与平板菌落计数法相比，操作更简单，更简易快速，更适合无很强专业技能的广大芽孢杆菌制剂生产从业者采用。
具体实施例方式实施例11材料与方法1.1实验材料复合芽孢杆菌粉BCM，通过平板计数法测定的活菌含量为SXlO^cfu/g，购于山西省卫氏鱼康实业有限公司；ImL玻璃移液管、无菌玻璃涂布棒、营养琼脂平板、营养肉汤、 50mL具塞离心管、载玻片、5%孔雀石绿水溶液、0.5%蕃红水溶液，购于国药集团化学试剂有限公司；ImL玻璃移液管、盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管，于121°C条件下灭菌20min;生化培养箱，购于日本三洋公司；漩涡振荡仪，购于上海淇特分析仪器有限公司； 温控摇床，购于美国i^orma kientific公司。1.2样品的制备无菌操作随机称取复合芽孢杆菌粉BCM 1 g，加入盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成样品，即1 10的稀释母液。实验共有3个平行样。1.3样品的稀释取3个平行样，分别进行如下处理无菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀释母液，加入盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成1 IO2的稀释液，这样依次稀释，分别得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U 109、 1 IO10U IO11U IO12U IO13等稀释度的稀释液，每次稀释时必须更换ImL玻璃移液管。1.4 培养将1 10 的稀释母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 等的稀释液置于转速为 200r/min、 温度为35 37°C的温控摇床中，培养18 Mh。以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照。1. 5 测定以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，无菌操作用ImL玻璃移液管吸取0. ImL培养18 24h变浑浊的各稀释液采用Schaeffer-Fulton氏染色法进行芽孢染色，显微镜观察有无绿色的芽孢。显微镜观察有绿色芽孢、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为复合芽孢杆菌粉BCM的活菌含量(cfu/g)。2实验结果实验结果见表1。实验结果表明，稀释度为1 IO11的复合芽孢杆菌粉BCM在培养 18 24h后浑浊，而且芽孢染色后显微镜下可观察到绿色的芽孢；而稀释度分别为1 IO12 和1 IO13的复合芽孢杆菌粉BCM在培养18 24h后均未浑浊，而且芽孢染色后显微镜下也未观察到绿色的芽孢。因此，复合芽孢杆菌粉BCM的活菌含量为IO11 1012cfu/g，与通过平板计数法测定的活菌含量相比，数量级相同，可作为复合芽孢杆菌粉BCM活菌总数快速定量的方法。表1复合芽孢杆菌粉BCM有效活菌总数的测定结果
权利要求
1. 一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法，其特征在于，包括如下步骤1)样品的制备无菌操作随机称取复合芽孢杆菌粉lg，加入盛有9mL无菌营养肉汤的 50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成1 10的稀释母液；2)样品的稀释无菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL1 10的稀释母液，加入盛有 9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成1 IO2的稀释液，这样依次稀释，分别得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U 1012、 1 IO13稀释度的稀释液；3)培养将1 10 的稀释母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀释液置于转速为 200r/min、温度为35 37°C的温控摇床中，培养18-24h ；以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照；4)测定以盛有9mL无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，用ImL玻璃移液管无菌操作吸取0. ImL培养18-24h变浑浊的各稀释液采用khaeffer-Fulton氏染色法进行芽孢染色，显微镜观察有无绿色的芽孢；显微镜观察有绿色芽孢、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为复合芽孢杆菌粉的活菌含量。
全文摘要
本发明提供了一种复合芽孢杆菌粉活菌含量的快速计数方法，是将待测样品经过适当稀释之后，其中的芽孢杆菌充分分散成单个细胞，然后在无菌营养肉汤中通过孵育培养而生长繁殖，从而形成肉眼可见的浑浊液，再进一步通过芽孢染色确定最大稀释度浑浊液中含有大量的芽孢，最后确定待测样品的活菌总数。本发明与显微镜直接计数法相比因能够区分死菌体和活菌体而使活菌总数的测定结果更准确，与平板菌落计数法相比，操作更简单，更简易快速，很适合广大芽孢杆菌制剂生产从业者采用。
文档编号C12Q1/06GK102392070SQ201110347608
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者何珊, 卫若鹏, 曹海鹏 申请人:山西卫氏鱼康实业有限公司, 山西省生物兽药饲料工程技术研究中心(有限公司)