专利名称：一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法
技术领域：
本发明涉及微生物测定技术，具体属于一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法。
背景技术：
噬菌蛭弧菌制剂是一种无毒副作用、无药物残留的绿色产品，内含丰富的具有独特噬菌特性的噬菌蛭弧菌，是水产养殖中常用的水质微生物改良剂。然而，缺少质量标准是噬菌蛭弧菌制剂在开发研制中存在的主要问题之一，而导致质量标准缺乏的最大的问题之一就是活菌数与标签不符，有些甚至难以检测到活菌。因此，稳定可靠的噬菌蛭弧菌制剂的计数方法无疑对噬菌蛭弧菌制剂正常生产及其质量控制具有重要的意义。目前，显微镜直接计数法、稀释倒自来水双层琼脂平板法等噬菌蛭弧菌制剂的传统计数方法由于存在一些缺陷，使计数结果不稳定。例如，显微镜直接计数法无法区分死菌体和活菌体，计数结果是死菌体和活菌体的总和；稀释倒自来水双层琼脂平板法因梯度稀释使噬菌蛭弧菌浓度不断降低，最终导致浓度低的噬菌蛭弧菌因检测不到而使检测结果不准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法。本发明提供的一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法，包括如下步骤1)样品的制备无菌操作随机称取噬菌蛭弧菌粉lg，加入盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成1 10的稀释母液，共设 3个平行样；2)样品的稀释取3个平行样，分别进行如下处理无菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀释母液，加入盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成1 IO2的稀释液，这样依次稀释，分别得到1 103、1 IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9等稀释度的稀释液，每次稀释时必须更换ImL玻璃移液管；3)培养将 1 10 的稀释母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9等的稀释液置于转速为200r/min、温度为；35 37°C的温控摇床中，培养M 32h ；以盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照；4)测定以盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，无菌操作用ImL玻璃移液管分别吸取0. ImL孵育M 3 变浑浊的各稀释液与大肠杆菌菌悬液同时加入0. 6%自来水软琼脂中65°C温育，待凝固后置于30°C生化培养箱中恒温培养 48 72h，观察有无噬菌斑的产生；将观察有噬菌斑产生、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为噬菌蛭弧菌粉的活菌含量(cfu/g)。本发明有效活菌总数定量测定的方法与显微镜直接观察法、稀释倒自来水双层琼脂平板法相比更准确，克服了稀释倒自来水双层琼脂平板法因稀释造成检测不准确、以及显微镜直接观察法无法区分死菌体、活菌体的弊端，可测定出噬菌蛭弧菌粉的有效活菌含量。
具体实施例方式实施例11材料与方法1.1实验材料噬菌蛭弧菌粉BBM，通过自来水双层琼脂平板法测定的有效活菌含量为 3Xl(fpfu/g，购于山西省卫氏鱼康实业有限公司；ImL玻璃移液管、无菌玻璃涂布棒、1. 5% 自来水琼脂平板、0. 6%自来水软琼脂(65°C温育)、营养肉汤、50mL具塞离心管、载玻片，购于国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌，购于TaKaRa公司；ImL玻璃移液管、营养肉汤、盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管、0. 6%自来水软琼脂(65°C温育)，于 121°C条件下灭菌20min ；生化培养箱，购于日本三洋公司；漩涡振荡仪，购于上海淇特分析仪器有限公司；温控摇床，购于美国i^orma kientific公司。1. 2大肠杆菌菌悬液的制备1.3样品的制备无菌操作随机称取噬菌蛭弧菌粉BBM lg，加入盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成样品，即1 10的稀释母液。实验共有3个平行样。1.4样品的稀释取3个平行样，分别进行如下处理无菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀释母液，加入盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成1 IO2 的稀释液，这样依次稀释，分别得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U IO7U 108、 1 IO9等稀释度的稀释液，每次稀释时必须更换ImL玻璃移液管。1.5 培养将1 10 的稀释母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等的稀释液置于转速为200r/min、温度为35 37°C的温控摇床中，培养 24 32h。以盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照。1.6 测定以盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，无菌操作用 ImL玻璃移液管分别吸取0. ImL孵育M 3 变浑浊的各稀释液与大肠杆菌菌悬液同时加入0. 6%自来水软琼脂(65°C温育)中，待凝固后置于30°C生化培养箱中恒温培养48 72h，观察有无噬菌斑的产生。将观察有噬菌斑产生、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为噬菌蛭弧菌粉的活菌含量(pfu/g)。2实验结果实验结果见表1。实验结果表明，稀释度为1 10 1 IO9的噬菌蛭弧菌粉BBM 在孵育M 32h后浑浊，而且稀释度为1 10 1 IO8在自来水双层琼脂平板上可观察到典型的噬菌斑；然而，稀释度为1 IO9的噬菌蛭弧菌粉BBM在孵育M 3 后虽然浑浊，但在自来水双层琼脂平板上未观察到典型的噬菌斑。因此，噬菌蛭弧菌粉BBM的有效活菌含量为IO8 lOYfu/g，与通过自来水双层琼脂平板法测定的噬菌蛭弧菌粉BBM有效活菌含量的数量级高1个数量级。表1噬菌蛭弧菌粉BBM有效活菌总数的測定结果
稀释度是否浑池有无噬菌斑
1 10是有—
1 IO2是有
1 IO3是有
1 IO4是有
1 IO5是有
1 IO6是有
1 IO7是有
1 IO8是有
1 IO9是无3 结论本实验有效活菌总数的定量方法与显微镜直接观察法、稀释倒自来水双层琼脂平 板法相比更准确，克服了稀释倒自来水双层琼脂平板法因稀释造成检测不准确、以及显微 镜直接观察法无法区分死菌体、活菌体的弊端，可測定出噬菌蛭弧菌粉BBM的有效活菌含 量。其原理是将待测样品经过适当稀释之后，其中的噬菌蛭弧菌充分分散成单个細胞，然后 在10倍稀释的无菌营养肉汤中通过孵育培养而生长繁殖，从而形成肉眼可见的浑浊液，再 进ー步通过噬菌斑检测确定最大稀释度浑浊液中含有大量的噬菌蛭弧菌，最后确定待测样 品的有效活菌总数。
权利要求
1. 一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法，其特征在于，包括如下步骤1)样品的制备无菌操作随机称取噬菌蛭弧菌粉lg，加入盛有9mL10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，于漩涡振荡仪上振荡混勻制成1 10的稀释母液，共设3个平行样；2)样品的稀释取3个平行样，分别进行如下处理无菌操作用ImL玻璃移液管吸取 ImL 1 10的稀释母液，加入盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管中，混勻成1 IO2的稀释液，这样依次稀释，分别得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等稀释度的稀释液，每次稀释时必须更换ImL玻璃移液管；3)培养将1 10 的稀释母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9等的稀释液置于转速为200r/min、温度为35 37°C的温控摇床中，培养 24 32h ；以盛有9mL 10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照；4)测定以盛有9mL10倍稀释的无菌营养肉汤的50mL具塞离心管作为对照，无菌操作用ImL玻璃移液管分别吸取0. ImL孵育M 3 变浑浊的各稀释液与大肠杆菌菌悬液同时加入0.6%自来水软琼脂(65°C温育)中，待凝固后置于30°C生化培养箱中恒温培养 48 72h，观察有无噬菌斑的产生；将观察有噬菌斑产生、且变浑浊的稀释液所对应的稀释度的倒数即为噬菌蛭弧菌粉的活菌含量。
全文摘要
本发明提供了一种噬菌蛭弧菌粉有效活菌含量的计数方法，是将待测样品经过适当稀释之后，其中的噬菌蛭弧菌充分分散成单个细胞，然后在10倍稀释的无菌营养肉汤中通过孵育培养而生长繁殖，从而形成肉眼可见的浑浊液，再进一步通过噬菌斑检测确定最大稀释度浑浊液中含有大量的噬菌蛭弧菌，最后确定待测样品的有效活菌总数。本发明的方法与显微镜直接观察法、稀释倒自来水双层琼脂平板法相比更准确，克服了稀释倒自来水双层琼脂平板法因稀释造成检测不准确、以及显微镜直接观察法无法区分死菌体、活菌体的弊端。
文档编号C12Q1/08GK102352405SQ20111034733
公开日2012年2月15日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者何珊, 卫若鹏, 曹海鹏 申请人:山西卫氏鱼康实业有限公司, 山西省生物兽药饲料工程技术研究中心(有限公司)