专利名称：：紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物诱变育种
技术领域：
，具体涉及紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用。
背景技术：
：对自然界中的微生物，如果只是简单地分离和纯化，择优选取菌种，很难获得优良菌种，且一般难以满足生产的需要。而微生物育种是指在人为的条件下，利用物理、化学等因素诱发微生物的遗传特性发生变异，并从中选择符合要求的具有特殊性状的优良菌种进行培育，使微生物有效应用于工业生产。蛭弧菌可侵染、裂解宿主细菌的特性使之适合作为抑止或清除食品及环境中致病菌的生物净化因子。但是，研究表明，一般情况下，蛭弧菌可以裂解大多数科、属的革兰氏阴性菌，但其裂解性能因不同菌株而异，而且他们不能裂解革兰氏阳性菌，纵使可以裂解极少数革兰氏阳性菌，裂解能力也极弱(曹海鹏,杨先乐等.异育银鲫肠道蛭弧菌的分离及其生物学特性的研究[J].微生物学报，2007(34):5256;谢群英，房文红等.蛭弧菌海水菌株Bdh5221裂解特性及生长影响因子研究[J].海洋渔业，2007(29):97102)。因此，在革兰氏阳性致病菌占优势的环境中，蛭弧菌将无法发挥其净化环境的能力，其应用就会受到限制。增强蛭弧菌的裂解性能，获得能够有效裂解革兰氏阳性菌的蛭弧菌，对保障人类身心健康具有重大意义。此故，目前国内外学者多采用自然筛选的方法，不仅时间长，而且难以筛选而得。紫外线诱变突迄今仍是微生物育种中最常用和最有效的方法之一，其具有突变频率较高且不易回复的优点，但是通过紫外诱导突变法以达到增强蛭弧菌裂解性能的研究，目前尚无任何报道。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，以紫外诱导突变的方法为手段，以增强蛭弧菌裂解性能为目的，提供一种紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用。以有效提高蛭弧菌对革兰氏阴性以及阳性致病菌的裂解能力，从而拓宽蛭弧菌的应用范围、更好地满足生产实践的需要。为达到上述冃的，本发明的主要技术方案如下本应用是以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCI强化诱变，它包括以下具体步骤及其条件；(1)稳定光波在暗室中，将紫外光源置于操作台面上方，辅助红外光源置于操作台面两侧，操作前3060min打开紫外光源，稳定光波，其紫外光源的功率为1025W，红外光源的功率为1550W;(2)无菌诱导突变在滤过可见光状态下，先将浓度大于105pfu/mL的蛭弧菌浓縮液加入无菌培养皿中，再向培养皿加入LiCl溶液并将其终浓度维持在0.10.5%，加入无菌磁力转子开启磁力搅拌，在缓慢搅拌下将培养皿置于紫外光源正下方，同时打开辅助红外光源，开始诱导突变，诱变时间为28min，照射距离为520cm;所述的蛭弧菌浓縮液是由蛭弧菌野生株5^//ovz力〃'osp.BDJOl经离心浓縮得到，蛭弧菌野生株B&〃oW6r/0sp.BDJOl在2008年1月13日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M208011;(3)冰浴保存关闭紫外、红外光源，取出菌液立即避光，并置于冰浴中保存至少1小时；(4)累加诱变用步骤(3)中裂解能力已有增强的蛭弧菌诱变株，按步骤(2)、(3)重复操作110次累加诱变，直至得到能裂解至少两种革兰氏阳性菌的蛭弧菌诱变株。步骤(4)中所述革兰氏阳性菌是指产气荚膜杆菌(C/o欣W,/^/〃力取m)、艰难梭菌(C7o欣W贈d浙"7e)、猪链球菌(浙epfococcws湖i)以及肠球菌(五"&racoccws);步骤(2)中所述蛭弧菌浓縮液浓度为105107pfu/mL。步骤(l)中所述紫外光源为功率1520W的紫外灯，辅助红外光源为功率2025W的红外线灯。步骤(2)中所述LiCl溶液的终浓度为0.20.3%。步骤(2)中诱变时间为46min，照射距离为815cm。本发明与现有技术相比具有如下优点-1、本发明采用紫外诱导突变法来增强蛭弧菌的裂解性能，为增强蛭弧菌的裂解性能提供了一种新方法。有效地提高了蛭弧菌对革兰氏阴性以及阳性致病菌的裂解能力，从而拓宽了蛭弧菌的应用范围、能够更好地满足生产实践的需要。2、本发明通过以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCl强化诱变效果，方法简单、操作方便，可适用于工业化生产的要求，对蛭弧菌的研究及应用均有现实意义。3、本发明增强蛭弧菌裂解性能效果显著，经实施例l、2中采用本发明增强蛭弧菌裂解性能的检验证实可以裂解原来不能裂解的两株沙门氏菌，以及数种革兰氏阳性菌，包括产气荚膜杆菌、艰难梭菌、猪链球菌以及肠球菌。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但实施方式并不仅限于此。实施例1以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCl强化诱变的应用包括以下具体步骤及其条件1.稳定光波在暗室中，将15W的紫外灯置于操作台面上方，作为辅助红外光源的功率为20W的红外灯置于操作台面两侧，提前30min打开紫外光源，稳定光波；2.无菌诱导突变将己保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M208011的蛭弧菌野生株^/e〃ov沾〃》平BDJOl培养液100mL在4'C、速度5000Xg的条件下离心20min，取离心后的上清液在4'C条件下再经12000Xg的速度离心20min，沉淀用10mLDNB液体培养基悬浮。将悬浮液经孔径为1.2um的纤维素微孔滤膜过滤，得到浓度为3X105pfu/mL蛭弧菌野生株浓縮液；其中培养液是按动物微生态研究进展(pl90，2000年，中国农业大学出版社)的培养方法培养，DNB液体培养基营养肉汤0.8g，酪氨酸酸水解物0.5g，酵母精提物O.lg，NaCl30g，蒸馏水1000mL，pH7.27.6。在滤过可见光状态下，将上述3X105pfu/mL蛭弧菌野生株浓缩液5mL加入9cm无菌培养皿中，再向培养皿中加入浓度为1.0%的1.25mLLiCl溶液，使其终浓度达0.2%，加入无菌磁力转子开启磁力搅拌，在缓慢搅拌下将培养皿置于紫外灯正下方，同时打开辅助红外光源，其照射距离为15cm;开始诱导突变，诱变时间为4min。3.冰浴保存关闭紫外灯与红外灯，取出菌液，马上用锡纸包裹避光，并置于冰浴中保存至少1小时以抑制修复。4.累加诱变用步骤3中裂解宿主能力已有所增强的蛭弧菌突变株，按步骤2、3重复操作六次累加诱变。蛭弧菌突变菌株裂解宿主能力的检验方法如下将革兰氏阴性菌一海藻施万氏菌、沙门氏菌菌株S029、S394，革兰氏阳性菌一产气荚膜杆菌、艰难梭菌、猪链球菌以及肠球菌分别接种于100mL2216E佐贝尔海洋细菌液体培养基中，置于转速为200rpm，温度为28°C的恒温摇床中培养14h，浓度约为10810"cfu/mL。培养液在4°C温度条件下，以5000Xg速度离心20min，沉淀下来的菌体用5mLDNB液体培养基重新悬浮，置于4°C冰箱保存备用。其中2216E佐贝尔海洋细菌液体培养基组分蛋白胨5g，酵母浸膏lg，磷酸高铁O.Olg，NaCl30g，蒸馏水1000mL，pH7.27.6。将本实施例紫外诱导突变后的蛭弧菌诱变株菌液与未经诱变的野生株菌液各0.5mL分别与上述三株革兰氏阴性菌与四株革兰氏阳性菌的浓縮液0.5mL混合均匀，静置30min，与5(TC的DNB上层培养基3.5mL混合均匀，倾注于DNB固体培养基上并铺平制成双层平板，放入恒温培养箱中28'C培养，观察平板上出现菌斑的情况。其中DNB上层培养基NaCl15g，蒸馏水500mL，pH7.27.6，琼脂粉3g;DNB固体培养基1000mLDNB液体培养基中添加15g琼脂粉。根据以色列学者Jurkevitch于2000年发表在《应用与环境微生物学》上的研究报告(Jurkevitch，E.，Minz，D.andRamati，B.2000.Preyrangecharacterization,ribotyping，anddiversityofsoilandrhizosphere5(ie〃ov/6〃'(5spp.isolatedonphytopathogenicbacteria.Appl.Environ.Microbiol.66，2365-2371.)，双层平板上所出现噬菌斑的数量可间接代表蛭弧菌的数量，噬菌斑的直径可间接代表蛭弧菌的裂解能力，噬菌斑的数量越多，直径越大，可说明蛭弧菌的裂解能力越强。将本实施例中第3步所得到的蛭弧菌诱变株按以上方法进行检验，由诱变前后蛭弧菌菌液制成的双层平板上的噬菌斑的数量和大小来判断其裂解性能，通过对比结果见表1。表1:实施例1的蛭弧菌诱变株与野生株的裂解性能比较(一次诱变)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表l中噬菌斑直径的单位为cm;噬菌斑数量的单位为个/平板，以下同。表1说明，观察双层平板上噬菌斑出现的结果，一次诱变后的蛭弧菌诱变株裂解海藻施万氏菌所出现的噬菌斑数量相对于野生株BDJ01由306个增加到375个;且裂解沙门氏菌S029的平板上也出现了噬菌斑，即由无斑增加到83个。这说明经一次紫外诱变后筛选到的蛭弧菌诱变株裂解海藻施万氏菌的性能有所增加，且开始能够裂解野生株所不能裂解的沙门氏菌S029，但是此时还没有表现出裂解阳性菌的能力。利用第一次诱变后的菌株继续累加诱变，其裂解性能或将继续提高。为此，将本实施例中第3步所得到的蛭弧菌诱变株经第4步再累加诱变六次，然后按同样方法进行检验，通过对比由诱变前后蛭弧菌菌液制成的双层平板上的噬菌斑状况来判断其裂解性能，筛选到的蛭弧菌诱变株与野生株比较的结果见表2。表2实施例1的蛭弧菌诱变株与野生株的裂解性能比较(六次累加诱变)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2说明，观察双层平板上噬菌斑出现的结果，相对于野生株，经六次累加诱变后的蛭弧菌诱变株裂解海藻施万氏菌所出现的噬菌斑数量由328个增加到450个；且能够裂解野生株所不能裂解的革兰氏阴性菌一沙门氏菌S029、S394和革兰氏阳性菌一肠球菌与艰难梭菌。这说明经六次紫外诱变后筛选到的蛭弧菌诱变株较野生株的裂解性能有较大提高。特别是诱变株裂解革兰氏阳性菌一肠球菌与艰难梭菌能力的出现，扩展了蛭弧菌的应用范围，为其应用到食品等行业提供了可能。实施例2以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCl强化诱变的应用包括以下具体步骤及其条件1.稳定光波在暗室中，将20W的紫外灯置于操作台面上方，作为辅助红外光源的功率为25W的红外灯置于操作台面两侧，提前60min打开紫外光源，稳定光波。2天茴i泰忌突变蛭弧菌野生株BDJOl的浓縮方法同实施例1，得到浓度为2X107pfu/mL的蛭弧菌野生株浓縮液；在滤过可见光状态下，将上述2Xl(^pfu/mL的浓縮液5mL加入9cm无菌培养皿中，再向培养皿中加入浓度为1.0%的1.67mLLiCl溶液，使其终浓度达0.25%，加入无菌磁力转子开启磁力搅拌，在缓慢搅拌下将培养皿置于紫外灯正下方，同时打开辅助红外光源，照射距离为8cm，开始诱导突变，诱变时间为6min。3.冰浴保存关闭紫外灯与红外灯，取出菌液，马上用锡纸包裹避光，并置于冰浴中保存至少1小时以抑制修复。4.累加诱变用步骤3中裂解能力已有增强的蛭弧菌诱变株，按步骤2、3重复操作十次累加诱变。蛭弧菌诱变株裂解能力的检验方法同实施例1，由诱变前后蛭弧菌菌液制成的双层平板上的噬菌斑状况来判断其裂解性能，通过对比结果见表3。表3实施例2的蛭弧菌诱变株与野生株的裂解性能比较(一次诱变)宿主菌野生株BDJ01经一次诱变后的菌株海藻施万氏菌沙门氏菌S029沙门氏菌S394产气荚膜杆菌肠球菌艰难梭菌噬菌斑直径1.51.8噬菌斑数量306410噬菌斑直径00噬菌斑数量00噬菌斑直径00噬菌斑数量00噬菌斑直径00噬菌斑数量00噬菌斑直径00嗜菌斑数量00噬菌斑直径00噬卤斑数量00噬菌斑直径00猪链球菌噬菌斑数量00表3中，一次诱变后的蛭弧菌诱变株裂解海藻施万氏菌所出现的噬菌斑直径由1.5增加至1.8cm，数量由306增加至410个。表示紫外诱变株的裂解能力略有增强。利用第一次诱变后的菌株继续累加诱变十次后的蛭弧菌诱变株的出斑情况见表4:表4实施例2的蛭弧菌诱变株与野生株的裂解性能比较(十次累加诱变)宿主菌野生株BDJ01经十次累加诱变后的菌株噬菌斑直径1.52.0海藻施万氏菌噬菌斑数量350450噬菌斑直径01.5沙门氏菌S029噬菌斑数量0180噬菌斑直径02.0沙门氏菌S394噬菌斑数量0265噬菌斑直径01.0产气荚膜杆菌噬菌斑数量0320噬菌斑直径02.5肠球菌嗜菌斑数量0120噬菌斑直径01.8艰难梭菌噬菌斑数量0158噬菌斑直径01.3猪链球菌噬菌斑数量0260表4的结果表明，经十次累加诱变后的蛭弧菌诱变株裂解性能继续提高，与野生株比较，不仅裂解革兰氏阴性菌一海藻施万氏菌的能力有增强，且能够裂解原来所不能裂解的革兰氏阴性菌一沙门氏菌S029与S394和革兰氏阳性菌一产气荚膜杆菌、艰难梭菌、猪链球菌以及肠球菌。至此，诱变菌株裂解革兰氏阴性菌的能力不仅得到了增强，且也表现出了较强的裂解革兰氏阳性菌的能力。实施例2中，十次紫外诱变后得到的蛭弧菌诱变株命名为^/e_/_/ow7_"'0邵.BDMOl已经在2008年4月28日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M208066。权利要求1、紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于，本应用是以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCl强化诱变，它包括以下具体步骤及其条件(1)稳定光波在暗室中，将紫外光源置于操作台面上方，辅助红外光源置于操作台面两侧，操作前30～60min打开紫外光源，稳定光波，其紫外光源的功率为10～25W，红外光源的功率为15～50W；(2)无菌诱导突变在滤过可见光状态下，先将浓度大于105pfu/mL的蛭弧菌浓缩液加入无菌培养皿中，再向培养皿加入LiCl溶液并将其终浓度维持在0.1～0.5％，加入无菌磁力转子开启磁力搅拌，在缓慢搅拌下将培养皿置于紫外光源正下方，同时打开辅助红外光源，开始诱导突变，诱变时间为2～8min，照射距离为5～20cm；所述的蛭弧菌浓缩液是由蛭弧菌野生株Bdellovibriosp.BDJ01经离心浓缩得到，蛭弧菌野生株Bdellovibriosp.BDJ01保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNOM208011；(3)冰浴保存关闭紫外、红外光源，取出菌液立即避光，并置于冰浴中保存至少1小时；(4)累加诱变用步骤(3)中裂解能力已有增强的蛭弧菌诱变株，按步骤(2)、(3)重复操作1～10次累加诱变，直至得到能裂解至少两种革兰氏阳性菌的蛭弧菌诱变株。2、根据权利要求1所述的紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于步骤(4)中所述革兰氏阳性菌是指产气荚膜杆菌、艰难梭菌、猪链球菌以及肠球菌。3、根据权利要求1所述的紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于步骤(2)中所述蛭弧菌浓縮液浓度为105107pfu/mL。4、根据权利要求1所述的紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于步骤(l)中所述紫外光源为功率1520W的紫外灯，辅助红外光源为功率2025W的红外线灯。5、根据权利要求1所述的紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于步骤(2)中所述LiCl溶液的终浓度为0.20.3/。。6、根据权利要求1所述的紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用，其特征在于步骤(2)中诱变时间为46min，照射距离为815cm。全文摘要本发明属于微生物诱变育种
技术领域：
，具体涉及紫外诱导突变在增强蛭弧菌裂解性能中的应用。本应用是以紫外线诱导突变为主，同时辅助以红外光源以及LiCl强化诱变，在缓慢搅拌下诱导突变，时间为2～8min，照射距离为5～20cm；避光冰浴保存，累加诱变直至达到所需。本发明方法简单、操作方便，增强蛭弧菌裂解性能效果显著，经检验证实可以裂解原来不能裂解的两株沙门氏菌，以及数种革兰氏阳性菌，包括产气荚膜杆菌、艰难梭菌、猪链球菌以及肠球菌，解决了通常蛭弧菌不能裂解革兰氏阳性菌、纵使可以裂解但裂解能力极弱的问题，拓宽了蛭弧菌的应用范围。文档编号C12N13/00GK101440362SQ200810220488公开日2009年5月27日申请日期2008年12月26日优先权日2008年12月26日发明者蔡俊鹏,韩晓宁申请人:华南理工大学