专利名称：一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及芽孢杆菌检测领域，具体涉及一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。
背景技术：
随着养殖环境的恶化，养殖过程中水质问题日益突出。目前芽孢杆菌制剂作为主 要水质改良产品，广泛应用于水产养殖行业。在养殖池塘中芽孢杆菌的生长繁殖是芽孢杆 菌发挥作用的前提条件。同时池塘中芽孢杆菌的数量变化情况是确定产品使用频率的依 据。因此跟踪检测池塘中芽孢杆菌的数量变化至关重要。但是由于池塘中细菌种类繁多， 而且芽孢杆菌在水体中往往不属于优势种群，芽孢杆菌的数量往往都在104CFU/ml以下，目 前常规的检测方法都存在一定的缺陷。目前常见的芽孢杆菌计数方法有平板计数法，最大或然数法和定量PCR法等。由 于其他细菌的干扰，常规的平板计数法和最大豁然数法不能选择性的检测芽孢杆菌数量。 目前检测水体中芽孢杆菌的方法为先将样品80°C水浴处理20min后进行平板计数，该方法 的缺陷在于不能检测芽孢杆菌的总数，而是仅仅检测芽孢杆菌中处于休眠状态的芽孢杆菌 数量。该方法得到的数据不能用于跟踪芽孢杆菌在水体中的繁殖情况。常用的荧光定量PCR 的方法可以水体中特定菌株的含量，但该方法需要昂贵的仪器设备，工序复杂，且检测费用 大。同时其他细菌会干扰引物和探针的特异性，水体中存在的有机和无机悬浮物会影响RNA 的提取，进而降低荧光定量PCR方法的可重复性。中国专利申请(200510U6211.0)公开了 一种微生物肥料中的芽孢杆菌数量的检测方法，该方法主要是将待测样品稀释液先进行高 温处理，这样可以打破产品中成熟芽孢的休眠，使之很快萌发形成菌落，同时杀死样品中未 能形成芽孢的菌体，使之提前死亡，但该申请中所用到的培养基是传统的营养琼脂培养基， 并未作出改进。专利申请(200910196640. 3)公开了一种芽孢杆菌活菌数量的检测方法，主 要是将样品中加入营养肉汤萌发剂培养，然后再涂板、计数。这种方法主要是通过高温处理 刺激成熟芽孢萌发，再经过萌发剂培养，让芽孢复苏，从而使检测的准确度提高。但该申请 中所用到的培养基依然是传统的营养琼脂培养基，并未作出改进。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的芽孢杆菌定量检测中存在的准确度低、无法检测芽 孢杆菌总数以及使用荧光定量PCR时带来的成本高的问题，提供一种成本低、准确度高的 用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。本发明另一目的在于提供上述选择性培养基的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种选择性培养基，每升该选择性培养基由如下组分组成葡萄糖广10g，酵母膏 广5g，蛋白胨5 10g，氯化钙0. 2 2g，硫酸镁0.广lg，琼脂15 20g和抑菌剂100 500 IU0作为一种优选方案，每升上述选择性培养基由如下组分组成葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钙lg，硫酸镁0. 5g和抑菌剂200 IU0更进一步地，上述蛋白胨优选为胰蛋白胨，所述抑菌剂为多粘菌素，其中，以硫酸 多粘菌素B为最佳。本发明选择性培养基可以用于定量检测芽孢杆菌。检测方法是以选择性培养基 制备平板，将待测样品稀释后涂布于平板上，培养，培养完毕后进行计数(待测样品的前处 理、平板的制备及涂布方法均根据GB4789. 2-94《中华人民共和国国家标准食品微生物学 检验菌落总数测定》的规定实施)。作为一种优选方案，上述检测方法中，所述培养时间为2(T3^!。培养为变温培养， 前6 12h为恒温4(T55°C培养，后12 3 为恒温3(T40°C培养。可否详细说明采用变温培 养的原因，以及通过变温培养可以带来怎样的有益效果？
作为一种最优选方案，所述培养的前1 为恒温45°C培养，后12h为恒温37°C培养。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明通过使用特定配方及用量组分组成的选择性培养基，使用变温培养的方法，可 以提高常规平板计数法对芽孢杆菌的选择性，消除待测样品中其它微生物或杂质的影响， 达到快速准确定量检测芽孢杆菌的目的。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1检测半咸水养虾塘中芽孢杆菌菌数
将芽孢杆菌含量为20X 108CFU/g的产品使用到南美白对虾池塘中，使用剂量为lppm， 1天后采样检测池塘水体中芽孢杆菌数量。具体检测方法如下
(1)样品预处理
取水样进行梯度稀释，变温培养组取1X，10X，100X三个稀释梯度的稀释液备用； 恒温培养组取100X，1000X，10000X三个稀释梯度的稀释液备用。
(2)选择性培养基平板的制备
按照以下配方配制固体培养葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钙1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸多粘菌素200IU/L和琼脂15 g/L，调节PH为7. 2，121°C灭菌 20min。待培养基冷却到45°C后，将约15ml培养基倾入无菌培养皿中，凝固后备用；
(3)涂布和培养
变温培养组取1X，10X，100X三个稀释梯度的稀释液备用；恒温培养组取100X， 1000 Χ, 10000X三个稀释梯度的稀释液进行涂布，每个平板添加稀释液0. 1ml，每个梯度 采用3个重复；然后将变温组的培养皿45°C恒温培养箱，培养12小时，然后将培养皿转移 到37°C恒温培养箱培养12小时；同时将恒温组的培养皿放入37°C，培养M小时。培养完 毕后即可进行计数统计。具体数据
表1变温培养后菌落计数数据
权利要求
1.一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基，其特征在于每升所述选择性培养基由 如下组分组成葡萄糖riOg，酵母膏广5g，蛋白胨5 10g，氯化钙0. 2 2g，硫酸镁0.广lg， 琼脂15 20g和抑菌剂100 500 IU0
2.根据权利要求1所述的用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基，其特征在于每升 所述选择性培养基由如下组分组成葡萄糖10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钙lg，硫酸镁 0. 5g和抑菌剂200 IU0
3.根据权利要求2所述的用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基，其特征在于所述蛋 白胨为胰蛋白胨。
4.根据权利要求2所述的用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基，其特征在于所述抑 菌剂为多粘菌素。
5.根据权利要求4所述的用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基，其特征在于所述多 粘菌素为硫酸多粘菌素B。
6.权利要求广5中任意一条权利要求所述的选择性培养基在定量检测芽孢杆菌中的应用。
7.根据权利要求6所述选择性培养基的应用，其特征在于所述检测方法如下以选择 性培养基制备平板，将待测样品稀释后涂布于平板上，培养，培养完毕后进行计数。
8.根据权利要求7所述选择性培养基的应用，其特征在于所述培养时间为2(T3^!。
9.根据权利要求8所述选择性培养基的应用，其特征在于所述培养为变温培养，前 6 12h为恒温40 55°C培养，后12 35h为恒温3(T40°C培养。
10.根据权利要求9所述选择性培养基的应用，其特征在于所述培养的前1 为恒温 45°C培养，后1 !为恒温37°C培养。
全文摘要
本发明公开了一种用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基。每升本发明选择性培养基由如下组分组成葡萄糖1~10g，酵母膏1~5g，胰蛋白胨5~10g，氯化钙0.2~2g，硫酸镁0.1~1g，琼脂15~20g和抑菌剂100~500IU。本发明用于定量检测芽孢杆菌的选择性培养基通过变温培养，可以提高常规平板计数法对芽孢杆菌的选择性，消除待测样品中其它微生物或杂质的影响，达到快速定量检测芽孢杆菌的目的。
文档编号C12R1/07GK102127518SQ20101061719
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者张家学 申请人:广州市容川饲料有限公司