拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌的应用

拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌的应用
【专利摘要】本发明公开了拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌的应用。该拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌是多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8527。多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可显著抑制牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniae)和芍药杂色尾孢霉菌(Cercospora varricolor Winter)，并显著促进牡丹的生长。CGMCC No.852720131209
【专利说明】
拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌的应用
[00011 本申请是申请号为201410117673.5、申请日为2014年03月26日、发明创造名称为 "一株拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌及其应用"的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及拮抗多种牡丹病原菌的多粘类芽孢杆菌的应用。
【背景技术】
[0003] 牡丹归芍药科(Paeoniaceae)、芍药属(Paeonia)，一直以来都是中国最重要的观 赏植物和药用植物之一，已有1600多年的历史。目前，牡丹在国内的主要栽培地点为荷泽、 洛阳、北京、临夏、天彭、铜陵等。近年来，牡丹的油用价值日渐凸显，油用牡丹的发展呈现出 快速扩张的态势。对于观赏牡丹来讲，一个突出的问题是，由于不同地区气候环境和土壤性 质的差异造成的土壤微生态活性降低，是引种地区栽培牡丹生长状况不良、观赏性状下降 的重要原因之一。而对于油用牡丹，如何科学施肥并显著提高牡丹籽的产量则是非常迫切 的问题。在牡丹的栽培过程中，还面临着一些真菌病害的威胁，主要有灰霉病（Botrytis paeoniae)、红斑病（Cladosporium aeoniae)和褐斑病（Cercospora paeoniae)等。因此，研 制促进牡丹生长并拮抗病原菌的微生物菌剂具有显著和迫切的现实意义。其中，筛选对牡 丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生细菌菌种资源是限制微生物菌剂发展的重要瓶 颈因素。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的一个技术问题是提供一株能拮抗多种牡丹病原菌、促进牡丹生 长并且能以玉米秸杆为原料生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌株。
[0005] 本发明所提供的菌株是多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101，已 于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)， 保藏登记号为CGMCC No.8527。
[0006] 所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的形态学特征如下:革 兰氏阳性，运动，菌体呈杆状，直径为0.6-0.8μπι，长为2.0-7.6μπι。芽孢柱状，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明显膨大成纺锤型或棒状。其菌落边缘不整齐裂片状，半透明 到不透明。后其菌落粗糙，浅白色，中间略突起。菌落粘着在培养基表面。
[0007] 所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生理生化特征如下：
[0008] 水解淀粉:阴性；
[0009] 水解酪蛋白：阴性；
[0010] 水解明胶:阴性；
[0011] 利用柠檬酸盐:阴性；
[0012]酪氨酸分解:阴性；
[0013]苯丙氨酸脱氨酶实验：阴性；
[0014]卵黄卵磷脂酶实验:阴性；
[0015] 剛噪产生:阴性；
[0016]马尿酸盐实验:阴性；
[0017]接触酶实验：阳性；
[0018] 硝酸盐还原实验：阳性；
[0019] 二羟丙酮产生：阳性；
[0020] 抗溶菌酶实验：阳性；
[0021] 分解葡萄糖产酸产气：阳性；
[0022] 分解阿拉伯糖产酸产气：阳性；
[0023]分解木糖产酸产气：阳性；
[0024]分解甘露醇产酸产气：阳性；
[0025] 耐盐性试验:7%NaCl生长；
[0026]在pH 6.8的营养肉汤培养基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉汤培养基中均可生长。 在MR-VP肉汤上产生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0027] 所述多粘类芽抱杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的 16SrDNA序列如SEQ ID No. 1所示。其中，SEQ ID No. 1由1496个核苷酸组成。
[0028] 本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的多粘类芽孢杆 菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101。
[0029] 该菌剂除包含作为活性成分的多粘类芽孢杆菌（Paenibacil Ius po lymyxa) CSM1101外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸杆、松壳、稻草、花生皮等。所 述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物 材料或高分子化合物;所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻 土中的至少一种;所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种;所述高分子化合物为 聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为水。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的 活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合 物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。 [0030] 所述多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可为下述A1)_A3)中任 一种菌剂：
[0031 ] Al)促进牡丹生长和拮抗病原菌的菌剂；
[0032] 所述病原菌为牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三种、任两种或任 一种。
[0033] A2)诘抗病原菌的菌剂;所述病原菌为牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹 枝抱霉(Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter) 中的二种、任两种或任一种。
[0034] A3)促进牡丹生长的菌剂。
[0035] 所述的多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制备所述A1)_A3) 中的任一种菌剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0036] 上述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101或上述菌剂的下述用 途也属于本发明的保护范围：
[0037] Cl)促进牡丹生长和拮抗病原菌；
[0038] C2)所述促进牡丹生长；
[0039] C3)所述拮抗病原菌。
[0040] 本发明还提供了一种促进牡丹生长的方法。
[0041] 本发明所提供的促进牡丹生长的方法，包括在生根前将浸种后的牡丹种子用所述 菌剂处理1-3小时(如1小时)再进行生根培养的步骤。
[0042]上述方法中，将浸种后的牡丹种子用所述菌剂处理的方式因所述菌剂的物理状态 而异，如果所述菌剂为液态，直接用所述菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子即可，所述菌剂中 的所述多粘类芽抱杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量可为108cfu/ml_ 109〇如/1111(如109〇;^/1]11) ;如果所述菌剂为固态，需要向所述菌剂中加水制成液体菌剂，再 用该液体菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子，所述液体菌剂中的所述多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的含量可为108cfu/ml-109cfu/ml (如 109cfu/ml)。 [0043]在本发明的一个【具体实施方式】中，所述牡丹为凤丹(Paeonia ostii)。
[0044] 上述文中，所述促进牡丹生长可体现为下述Bl)-B7)中的任一种：
[0045] BI)缩短牡丹种子生根时间；
[0046] B2)提高牡丹种子生根率；
[0047] B3)缩短牡丹种子的发芽时间；
[0048] B4)提高牡丹种子的发芽率；
[0049] B5)提高牡丹的主根长度；
[0050] B6)提高牡丹苗高；
[0051] B7)提高牡丹幼苗生物量；
[0052]所述提高牡丹幼苗生物量体现为提高牡丹幼苗的鲜重或干重。
[0053] 上述方法中，所述病原菌可为牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 种、任两种或任一种。
[0054] 本发明的又一目的是提供一种培养多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) CSM 1101的方法。
[0055] 本发明所提供的培养多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的方 法，包括将多粘类芽孢杆菌(PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101在用于培养多粘类芽孢杆 菌的培养基中培养的步骤。
[0056] 本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法。
[0057] 本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括如下步骤:将所述的多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101作为活性成分，得到所述菌剂。
[0058] 本发明的多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101可显著抑制牡丹 葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾孢霉 菌（Cercospora varricolor Winter)，对它们的抑菌率分别达到了57 · 2 %、65 · 7 % 和 88.3%。本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101处理的牡丹种子(菌 剂组层积处理）的生根时间比对照组层积处理提前了 10天;菌剂组层积处理的生根率达到 95.0%，比对照组层积处理(未用菌剂处理）的生根率提高了 33.8%;菌剂组层积处理的主 根长度为69.0mm，是对照组层积处理的1.68倍;菌剂组层积处理的主根长度2 40mm的种子 百分率达到90±0.5%，是对照组层积处理的1.3倍;菌剂组层积处理的发芽时间比对照组 层积处理缩短了 10天;菌剂组层积处理的发芽率达到99.0%，是对照组层积处理的1.2倍； 菌剂组层积处理的苗高是对照组层积处理的1.77倍，菌剂组层积处理的干重是对照组层积 处理的2.27倍。说明以多粘类芽抱杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No. 8527为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂不但拮抗牡丹病原菌还显著地促 进了牡丹种子的生根(胚根萌发)和发芽(胚芽萌发)和牡丹幼苗的生长。
[0059] 保藏说明
[0060] 菌种名称:多粘类芽孢杆菌
[0061] 拉丁名：PaenibaciIlus polymyxa
[0062] 菌株编号：CSM 1101
[0063]保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0064] 保藏机构简称:CGMCC
[0065]地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0066] 保藏日期：2013年12月09日
[0067] 保藏中心登记入册编号:CGMCC No .8527
【附图说明】
[0068]图1为菌剂组层积处理和对照组层积处理部分种子生根培养60天的照片。
[0069] a为对照组层积处理，b为菌剂组层积处理。
【具体实施方式】
[0070]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071 ] 下述实施例中所用的牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)ACCC36053和牡丹枝孢 霉(Cladosporium paeoniae)ACCC36063于本申请的申请日前均收藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC，地址:北京市海淀区中关村南大街12号，中国农 业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，这两个菌株的收藏日均为2006年8月 31日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌 株。
[0072]下述实施例中所用的牡丹褐斑病病原菌为苟药杂色尾孢霉菌（Cercospora varricolor Winter)(张建国，2001 ·牡丹的主要病害及防治·中国花丼园艺，23:32-34)公 众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它 用途使用。
[0073]下述实施例中的牡丹为凤丹（Paeonia ostii)(Jigang Han,Yao Song,Zhigang Liu，etc·201I·Culturable bacterial community analysis in the root domains of two varieties of tree peony(Paeonia ostii).FEMS Microbiol Lett，322:15-24)公众 可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用 途使用。
[0074] 下述实施例中所用的培养基如下：
[0075] 半固体D6bereiner 无氮培养基：鹿糖，IOg;苹果酸，5g;KH2PO4 · H2O，0 · 4g; K2HPO4 · H20,0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g; Na2MoO4 · 2H20,0.02g;琼脂，3g;用蒸馏水定容至1000 mKpH 7.0-7.23211:蒸气灭菌 20min〇
[0076] D0bereiner无氮培养基：鹿糖，IOg;苹果酸，5g;KH2P〇4 · H2〇,0.4g;K2HP〇4 · H2O， 0.1g;MgS〇4 · 7H2〇,0.2g;NaCl，0.1g;CaCl2 · 2H2〇,0.02g;FeCl3,0.01g;Na2Mo〇4 · 2H2O， 0.02g;琼脂18g;用蒸馏水定容至1000ml、pH 7.〇-7.2。121<€蒸气灭菌2〇111；[11。
[0077] NB培养基:葡萄糖5 · Og，蛋白胨5 · Og，牛肉膏3 · Og，用蒸馏水定容至1000ml，pH7 · 0-7.2，121°C 灭菌 20min。
[0078] NA培养基：葡萄糖5. Og，蛋白胨5. Og，牛肉膏3. Og，琼脂18g，用蒸馏水定容至 100〇1111，？!17.〇-7.2，121。(：灭菌2〇11^11。
[0079] PDA培养基:葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯200g，加水1000 mL煮沸30min滤取汁液，加 水补足 1000ml，pH6.0-7.0，121°C灭菌20min。
[0080] 下述实施例中的纤维素酶购于生工生物工程(上海)股份有限公司。下述实施例中 的纤维素酶酶活力单位(FPU)定义为Ig纤维素酶粉在55°C下60min内水解滤纸所得葡萄糖μ m ο 1数。纤维素酶酶活力的具体测定方法如下：取纤维素酶10.0 0 g，加10 0 m 1 ρ H 4.8 5的 0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液充分溶解，得到纤维素酶液，将纤维素酶液稀释后，吸取 0.5ml，加入0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液1.5ml，I X 6cm新华一号滤纸条一张，55 °C下水解 60min。水解完毕后采用如下的DNS法测定体系中的葡萄糖含量，并计算纤维素酶的酶活力。
[0081] 下述实施中，发酵培养基中葡萄糖含量的测定方法采用DNS法，具体如下：
[0082] (I)DNS试剂的配制：200g酒石酸钾钠，溶于一定量的水中，加热溶解，添加10.0g3， 5-二硝基水杨酸，IOg NaOH溶解后加入2g苯酸，0.5g无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却 至室温，定容至l〇〇〇ml。
[0083] (2)葡萄糖标准曲线的绘制:准确称取100.Omg分析纯的无水葡萄糖(预先在105°C 干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，再定容到刻度、摇匀，浓度 为lmg/mL。取10支试管，分别加入葡萄糖标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0 mL、 1.2mL、1.6mL后，用蒸馏水稀释至2mL，再加入2.5mL DNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。 取出后即用水冷却至室温，定容到25ml，摇匀。30min后于520nm下测OD值。以OD 52q值为纵坐 标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线，形式为Y = aX+b。
[0084] (3)发酵液中葡萄糖浓度的测定:取稀释到一定浓度的发酵上清液(4000r/min，离 心20min)，加入2.5mL DNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。取出用水冷却到室温，定容至 25mL，摇匀，静置30min后于520nm出测OD 52q值。根据样品的OD52q值与标准曲线计算发酵液中 的葡萄糖含量。
[0085] 实施例1、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的分离与鉴定
[0086] -、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的分离
[0087] 从安徽省铜陵市顺安镇金山村丹皮种植地的牡丹(Paeonia ostii，凤丹）（株龄6 年)植株的根际采集土样，将土样放入装有无菌水和灭菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min 振荡20min;取振荡后的悬液做系列梯度稀释，IO3UO4稀释度悬液各吸取200μ1均匀涂布 ffibere i ner无氮培养基，置30°C培养4d后，挑取单菌落，在DSbere i ner无氮培养基固体培 养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为牡丹根际 固氮菌CSM 1101。
[0088] 二、牡丹根际固氮菌CSM 1101的鉴定 [0089] 1.形态特征观察和生理生化特性测定
[0090]形态学和生理生化特性鉴定参考"伯杰氏系统细菌学手册"（Garrity，2001)和"一 般细菌学常用鉴定方法"（东秀珠等，2001 )，按照常规方法进行。
[0091]牡丹根际固氮菌CSM 1101的形态学特征如下：革兰氏阳性，运动，菌体呈杆状，直 径为0.6-0.8μπι，长为2.0-7.6μπι。芽孢柱状，1.6-3.5 X 1.2-1.5μπι，中生到次端生。孢子囊明 显膨大成纺锤型或棒状。其菌落边缘不整齐裂片状，半透明到不透明。后其菌落粗糙，浅白 色，中间略突起。菌落粘着在培养基表面。
[0092] 牡丹根际固氮菌CSM 1101的生理生化特征测定结果如下：
[0093]水解淀粉:阴性；
[0094]水解酪蛋白：阴性；
[0095]水解明胶:阴性；
[0096]利用柠檬酸盐：阴性；
[0097]酪氨酸分解:阴性；
[0098]苯丙氨酸脱氨酶实验：阴性；
[0099]卵黄卵磷脂酶实验:阴性；
[0100] 吲哚产生：阴性；
[0101] 马尿酸盐实验:阴性；
[0102] 接触酶实验:阳性；
[0103] 硝酸盐还原实验：阳性；
[0104] 二羟丙酮产生：阳性；
[0105] 抗溶菌酶实验:阳性；
[0106] 分解葡萄糖产酸产气：阳性；
[0107] 分解阿拉伯糖产酸产气：阳性；
[0108] 分解木糖产酸产气：阳性；
[0109] 分解甘露醇产酸产气：阳性；
[0110] 耐盐性试验:7%NaCl生长；
[0111] 在pH 6.8的营养肉汤培养基(NB)和pH 5.7的沙氏葡萄糖肉汤培养基中均可生长。 在MR-VP肉汤上产生乙酰甲基甲醇，pH 6.0。
[0112] 2.16S rDNA的序列扩增和分析
[0113] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司）提取基因组DNA作为PCR反应的模 板。PCR 引物（Pf 5 ' -CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ' 和Pr 5 ' -CGGGATCCAA GGAGGTGATCCAGCC-3'）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9700PCR扩增细菌的 16S rDNA。反应体系为 10XPCR buffer，2.5uL; dNTP (2 · 5mM) (TaKaRa)，2uL，Pf (IOpmo I/uL) O · IuL，Pr (IOpmo I/uL) O · IuL，Taq聚合酶（5U/ uL) (TaKaRa)，0.125uL，基因组DNA 0.5uL，加 CldH2O至25UUPCR反应条件为，94°C预变性 5min，94°C 变性 lmin，52°C 复性 lmin，72°C 延伸 lmin，72°C 最后延伸 10min，30 个循环。PCR 扩 增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化并测序。将菌株的16S rDNA序列在 GenBank核酸序列数据库进行序列比较分析。
[0114] 结果表明测得的牡丹根际固氮菌CSM 1101 16S rDNA序列全长I 496bp JnSEQID No· 1。在GENBANK进行blastn分析的结果表明，其序列与Paenibacillus polymyxa strain M-I (EF656457)的相似性达到99%。
[0115] 根据牡丹根际固氮菌CSM 1101的形态特征、生理生化特征和16s rDNA序列同源性 分析结果，将牡丹根际固氮菌CSM 1101鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibaci Ilus polymyxa)。多粘类芽抱杆菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 已于2013年 12月09 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区 北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.8527。
[0116] 实施例2、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的生物活性
[0117] -、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的固氮活性测定
[0?18] 固氮活性测定米用乙炔还原法。在15mm X 15mm螺口试管中加入2 · 5mL半固体 D:0berei.n:er_无氮培养基，接种多粘类芽孢杆菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No. 8527后，塞好棉塞，30°C培养24h;再换无菌胶塞密封，抽出10%气体，注入相同体 积的乙炔，30°C培养24h。抽取气样在Varian VISTA 6000型气相色谱仪上测定ARA (acetyiene reduction activity，乙炔还原活性）。实验设三个重复，取其平均值并计算方 差不大于5%。
[0119] 测定结果表明，CSM 1101在DSbereiner无氮培养基中表现出了较高的固氮活性。 其乙炔还原活性为12.6C2H4nmol ml/l·1。
[0120] 二、多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 的抑菌活性
[0121 ]以牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063、苟药杂色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的任一菌株 单独为病原菌，均采用平板对峙法测定抑菌率，具体方法如下:病原菌菌株在roA斜面上活 化后，加入无菌水制成病原菌悬浮液，将病原菌悬浮液加到融化后冷却到45-50 °C的PDA培 养基中混匀倒平板，在30°C培养4天，得到病原菌平板，用直径为6mm的打孔器打取病原菌菌 饼。
[0122] 按照如下方法测定多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101对每种 病原菌的抑菌率:实验重复三次，每次重复病原菌设两个处理，即CSM 1101组和对照组。将 20个无菌HM平板均分为两组，即CSM 1101组和对照组，每组10个平板，进行以下接种处理： 在CSM 1101组的无菌PDA平板中心接种直径为6mm的病原菌菌饼，将多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527斜面活化菌种接种于距病原菌菌饼 3cm处。同时，在对照组的无菌PDA平板中心只接种直径为6mm的病原菌菌饼。将经过上述接 种处理的CSM 1101组平板和对照组平板在30°C培养5-7天，待对照组平板(仅接种病原菌） 长满整个培养皿时，测量对照组的病原菌菌落直径和CSM 1101组的病原菌菌落直径，计算 抑菌率。
[0123] 抑菌率（％ )=(对照组的病原菌菌落直径-CSM 1101组的病原菌菌落直径)/对照 组的病原菌菌落直径X100。
[0124] 结果如表1所不，表明多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No · 8527对牡丹葡萄抱菌（Botrytis paeoniae)ACCC36053、牡丹枝抱霉（Cladosporium paeoniae)ACCC36063和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)均具有较强 的平板抑菌活性，其抑菌率分别达到了57.2%、65.7%和88.3%。
[0125]表 1 多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527对病原 菌的抑菌率
[0131]实施例3、利用玉米秸杆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A
[0132] I、发酵培养基的制备
[0133] 取玉米秸杆SOOOg(以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180°C和1.0 Mpa的条 件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸杆;将该经过预处理的玉米 秸杆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸杆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重 计每200克干秸杆加入IL蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55°C，IOOrpm(旋转半径20mm)，pH = 4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即 为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升 所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g;每升所述发酵培养基中，（NH4) 2S〇4的含量为10g、 MgSO4的含量为0.4g、CaC03的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
[0134] 2、发酵培养
[0135] 2.1种子培养
[0136] 将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 养基斜面上活化培养后取2 - 3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
[0137] 2.2发酵培养
[0138] 取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121°C灭菌20min，冷却后， 将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量(V/V)为10%。培养温度为30°C，通过调节通气 量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养 14小时时补加步骤1的酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为15g/L，继续培养16小时，结 束发酵。总共发酵30小时。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均 值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌(Paenibaci IIus poIymyxa)CSM 1101的 含量为2.58 X IO1t3Cfu/mL，芽孢含量为85%。将该发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合， 喷雾干燥后(60°C)制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A。
[0139] 实施例4、利用玉米秸杆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B
[0140] 1、发酵培养基的制备
[0141] 取玉米秸杆SOOOg(以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180°C和1.0 Mpa的条 件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸杆;将该经过预处理的玉米 秸杆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸杆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重 计每200克干秸杆加入IL蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55°C，IOOrpm(旋转半径20mm)，pH = 4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即 为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升 所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g;每升所述发酵培养基中，（NH4) 2S〇4的含量为10g、 MgSO4的含量为0.4g、CaC03的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
[0142] 2、发酵培养
[0143] 2.1种子培养
[0144] 将多粘类芽孢杆菌（？&611化3(^11118口〇1711^13)05]\111010610：吣.8527在嫩培 养基斜面上活化培养后取2 - 3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
[0145] 2.2发酵培养
[0146] 取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121°C灭菌20min，冷却后， 将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量(V/V)为10%。培养温度为30°C，通过调节通气 量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养 24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结 果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量为 1.86 X IO8Cfu/mL，芽孢含量为85 %。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥 后(60°C)制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B。
[0147] 实施例5、利用玉米秸杆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C
[0148] 1、发酵培养基的制备
[0149] 取玉米秸杆8000g (以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200 °C和2. OMpa的条 件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸杆;将该经过预处理的玉米 秸杆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸杆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重 计每200克干秸杆加入IL蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55°C，IOOrpm(旋转半径20mm)，pH = 4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即 为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为60g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升 所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g;每升所述发酵培养基中，（NH4) 2S〇4的含量为10g、 MgSO4的含量为0.4g、CaC03的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
[0150] 2、发酵培养
[0151] 2.1种子培养
[0152] 将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527在NA培养 基斜面上活化培养后取2 - 3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振幅， 200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
[0153] 2.2发酵培养
[0154] 取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121°C灭菌20min，冷却后， 将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量(V/V)为10%。培养温度为30°C，通过调节通气 量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养 24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结 果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量为 2.78 X IO9Cf u/mL，芽孢含量为85 %。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥 后(60°C)制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C。
[0155] 实施例6、利用玉米秸杆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂D
[0156] 1、发酵培养基的制备
[0157] 取玉米秸杆SOOOg (以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200 °C和2. OMpa的条 件下进行水热处理IOmin后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸杆;将该经过预处理的玉米 秸杆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸杆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重 计每200克干秸杆加入IL蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55°C，IOOrpm(旋转半径20mm)，pH = 4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即 为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为46g/L。用酶 解液、（NH4) 2S〇4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、（NH4) 25〇4、185〇4、0&0)3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升 所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g;每升所述发酵培养基中，（NH4) 2S〇4的含量为10g、 MgSO4的含量为0.4g、CaC03的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
[0158] 2、发酵培养
[0159] 2.1种子培养
[0160] 将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 养基斜面上活化培养后取2-3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
[0161] 2.2发酵培养
[0162] 取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121°C灭菌20min，冷却后， 将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量(V/V)为10%。培养温度为30°C，通过调节通气 量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养 24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结 果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus p〇lymyxa)CSM 1101的含量为 4.42 X IO8Cfu/mL，芽孢含量为85 %。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥 后(60°C)制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂D。
[0163] 对比例:利用淀粉质原料生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂E
[0164] 1、发酵培养基配制
[0165] 发酵培养基：用淀粉、（NH4)2S04、MgS04、CaCO 3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵 培养基由淀粉、（NH4)2S〇4、MgS〇4、CaC0 3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述淀粉 的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g;每升所述发酵培养基中，（NH 4)2SO4的 含量为l〇g、MgS〇4的含量为0.4g、CaC0 3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。）
[0166] 该对比例的发酵培养基中采用的组分除将玉米秸杆酶解液替换为等葡萄糖含量 的淀粉外，发酵培养基中的其它组分其它均与实施例3-6相同。
[0167] 2、发酵培养
[0168] 该发酵培养中，发酵液的制备方法与实施例4-6相同，具体如下：
[0169] 2.1种子培养
[0170] 将多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa)CSM 1101 CGMCC No.8527在NA培 养基斜面上活化培养后取2 - 3环接种到500ml三角瓶内的50ml NB培养基中。28°C，26mm振 幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
[0171] 2.2发酵培养
[0172] 取50L发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121°C灭菌20min，冷却后，将2.1所 得的种子液接入发酵培养基，接种量(V/V)为10%。培养温度为30°C，通过调节通气量和搅 拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30 %，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养24小 时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表 明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101的含量为3.66 X 109cfu/mL，芽孢含量为85 %。将发酵液喷雾干燥后(60°C )制粒，得到促进牡丹生长并拮 抗病原菌的菌剂E。
[0173] 实施例7、促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂促进牡丹种子萌发和牡丹幼苗生长
[0174] 种子采收:7月以果皮蟹黄为标准采收凤丹(Paeonia ostii)朞荚果(安徽省铜陵 市顺安镇金山村），置室内阴干至果皮开裂后收集种子，〇.5%KMn04浸泡2h进行消毒得到消 毒后的凤丹(Paeonia ostii)种子用于试验。试验地点为上海市松江区上海辰山植物园。
[0175] 多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌悬液的制 备:将实施例3的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A悬浮于无菌水中得到多粘类芽孢杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC Νο·8527菌悬液，使菌悬液中多粘类芽抱杆菌 (Paenibacillus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527的含量为 109cfu/mL。
[0176] 取消毒后的凤丹(Paeonia ostii)种子，用50°C无菌水浸种24h得到浸种后的凤丹 (Paeonia ostii)种子，以下简称浸种后的牡丹种子，进行下述种子生根(胚根萌发)实验和 发芽(胚芽萌发)实验。种子生根(胚根萌发)实验和发芽(胚芽萌发)实验均重复三次，每次 重复设置两种处理，即菌剂组层积处理和对照组层积处理。种子生根(胚根萌发)实验中，每 种处理300粒浸种后的牡丹种子。发芽（胚芽萌发）实验中，每种处理选取50粒主根长度2 40mm并且长度一致的生根种子。具体实验方法如下：
[0177] 1、种子生根(胚根萌发)实验
[0178] 菌剂组层积处理和对照组层积处理这两种处理中除生根前预处理方式不同外，其 它处理方式完全相同。菌剂组层积处理的生根前预处理如下：将浸种后的牡丹种子置于多 粘类芽抱杆菌（PaenibaciIlus polymyxa)CSM 1101CGMCC No.8527菌悬液（109cfu/mL)中 在25-30°C浸泡1小时，完成生根前预处理。对照组层积处理的生根前预处理如下:将浸种后 的牡丹种子在25-30Γ置于无菌水中浸泡1小时，完成生根前预处理。然后将完成生根前预 处理的种子均进行如下生根培养:将完成生根前预处理的种子与含水量为400%的高温灭 菌的珍珠岩(层积基质）按照1:3的体积比混匀后，装入聚乙烯塑料袋均置于10°C-25°C(昼 20-25Γ，夜10-15Γ)进行生根培养。每天观察1次，调查生根时间，生根培养90d调查测定生 根率、主根长度、主根长度2 40mm的种子百分率。数据用SPSS软件进行差异显著性分析。
[0179] 其中，以胚根露出种皮的长度为种子长度的1/2为生根。
[0180] 生根率=(L1/L0)X100%;
[0181 ] LI:生根实验种子中生根种子粒数;LO:生根实验种子粒数。
[0182] 2、发芽(胚芽萌发)实验
[0183] 分别取步骤1的菌剂组层积处理和对照组层积处理这两种处理得到的主根长度2 40mm并且长度一致的生根种子在4 °C贮藏21天后，栽植于高IOcm装有泥炭和珍珠岩的穴盘 中，置于l〇-25°C温室(昼20-25°C，夜10-15°C)中进行发芽培养成苗，每天观察1次，测定发 芽时间，发芽培养90d测定发芽率、苗高、整个牡丹幼苗植株的干重，计算发芽率。数据用 SPSS软件进行差异显著性分析。
[0184] 其中，以胚芽露出种皮为发芽。
[0185] 发芽率=(1^/LO') X 100%;
[0186] LI':发芽实验种子中发芽种子粒数;LO':发芽实验种子粒数。
[0187] 结果如表3-表5所示，菌剂组层积处理的生根时间比对照组层积处理提前了 10天； 菌剂组层积处理的生根率达到95.0%，比对照组层积处理的生根率提高了33.8% ;菌剂组 层积处理的主根长度为69.0mm，是对照组层积处理的1.68倍;菌剂组层积处理的主根长度 2 40mm的种子百分率达到90±0.5%，是对照组层积处理的1.3倍;菌剂组层积处理的发芽 时间比对照组层积处理缩短了 10天;菌剂组层积处理的发芽率达到99.0%，是对照组层积 处理的1.2倍;菌剂组层积处理的苗高是对照组层积处理的1.77倍，菌剂组层积处理的干重 是对照组层积处理的2.27倍。说明以多粘类芽孢杆菌（？3611；^3(3；[11118口017111713)031 1101CGMCC No.8527为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂显著地促进了牡丹种 子的生根(胚根萌发)和发芽(胚芽萌发)和牡丹幼苗的生长。图1显示了菌剂组层积处理和 对照组层积处理部分种子生根培养60天的情况。
[0188] 表3、菌剂处理对牡丹种子生根的影响
[0190] 注:表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显 著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。生根时间是指第1粒种子生根的时间。 [0191]表4、菌剂处理对牡丹种子发芽的影响
L0193」注：表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显 著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。发芽时间是指第1粒主根长度2 40mm的 生根种子发芽的时间。
[0194]表5、菌剂处理对牡丹幼苗生长的影响
[0196] 注:表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显 著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。苗高是幼苗地上部分的高度，干重是整
【主权项】
1 ·多粘类芽抱杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在制备下述A1 )_A3)中的任一 种菌剂中的应用： A1)促进牡丹生长和拮抗病原菌的菌剂； 所述病原菌为牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉（Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌(Cercospora varricolor Winter)中的三种、任两种或任 一种； A2)诘抗病原菌的菌剂;所述病原菌为牡丹葡萄孢菌(Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢 霉（Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的 二种、任两种或任一种； A3)促进牡丹生长的菌剂； 所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CSM 1101在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8527。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述促进牡丹生长体现为下述B1 )-B7)中 的任一种： B1)缩短牡丹种子生根时间； B2)提高牡丹种子生根率； B3)缩短牡丹种子的发芽时间； B4)提高牡丹种子的发芽率； B5)提高牡丹的主根长度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量。3. 促进牡丹生长的方法，包括在生根前将浸种后的牡丹种子用菌剂处理1-3小时再进 行生根培养的步骤；所述菌剂的活性成分为所述多粘类芽孢杆菌（Paenibaci 1 lus polymyxa)CSM 1101〇4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述促进牡丹生长体现为下述Bl)-B7)中 的任一种： B1)缩短牡丹种子生根时间； B2)提高牡丹种子生根率； B3)缩短牡丹种子的初萌期； B4)提高牡丹种子的发芽率； B5)提高牡丹的主根长度； B6)提高牡丹苗高； B7)提高牡丹幼苗生物量； 所述诘抗病原菌为诘抗牡丹葡萄孢菌（Botrytis paeoniae)、牡丹枝孢霉 (Cladosporium paeoniae)和苟药杂色尾抱霉菌（Cercospora varricolor Winter)中的三 种、任两种或任一种。
【文档编号】A01C1/00GK105861378SQ201610308942
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年3月26日
【发明人】韩继刚, 王云山, 胡永红
【申请人】上海辰山植物园