一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶催化领域，更具体地涉及一种不对称转化制备（S)-4-氯-3-羟基丁 酸乙酯的重组大肠杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 光学纯的（S) _4_ 氯-3-羟基丁 酸乙醋（Ethyl 4-chloro_3-hydroxyrate， (S)-CHBE)是一种重要的有机中间体，其最主要的用途是作为合成降胆固醇药物阿托伐他 汀的前体化合物。其手性单一对映体（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE)同样可用于 其他很多活性药物的合成，如羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂和1，4_二氢吡啶 类0 _阻滞剂等。
[0003] 潜手性物质4-氯乙酰乙酸乙醋（Ethyl 4-chloro_3-〇xobutanoate，C0BE)具有易 于合成且价格低廉的优点，以其为反应底物进行不对称还原反应获取（S)-CHBE是非常经 济有效的制备途径。
[0004] 目前，以C0BE不对称还原制备手性CHBE的研宄已经有很多的报道。主要制备方法 分为化学催化不对称还原法和微生物法两种。其中化学催化不对称还原法所用催化剂包括 了价格昂贵的铑、钌等金属，并且最终产率低，耗能高，污染大。相比之下，微生物催化法有 着反应条件温和，反应迅速，副产物产生少，产物的处理简单等优势，因此越来越受到关注。 然而，由于微生物细胞内存在的酶系复杂，往往催化产物的光学纯度不高，同时需要辅酶的 加入提供反应还原力。
[0005] 以重组的还原酶直接进行催化反应，需要按照化学剂量添加大量昂贵的辅酶 (NADH、NADPH)。因此，为了获得高产量、高纯度的（S)-CHBE，需要克隆脱氢酶基因实现辅酶 的高效原位再生，以提供一种高效率的辅酶再生循环体系。Yasohara等人从400株酵母菌 中筛选得到一株Candida magnoliae菌株，在水/乙酸正丁醋体系中，以添加葡萄糖、NADP 和葡萄糖脱氢酶用于辅酶循环，最终产物（S)-CHBE在有机相的积累量可达550mM，产物的 光学纯度对映体过量值（enantiomeric excess e.e)达到96%。然而，该最终产物积累量 和产物e. e值在本领域仍然并不理想。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种不对称转化制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大 肠杆菌及其应用，从而解决现有技术中的化学法催化产物的产率低，耗能高，污染大，微生 物法催化产物的产量低，光学纯度不高，并且需要额外添加辅酶的缺陷。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0008] 提供一种不对称转化制备（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌，所述重组 大肠杆菌是同时具有幾基还原酶基因（Carbonyl reductase from Synechocystis sp.PCC 6803，SrCR)和葡萄糖脱氢酶基因（Glucose dehydrogenase from Bacillus subtilis， ⑶H)的大肠杆菌。
[0009] 其中，羰基还原酶SsCR基因含有723bp碱基，其在Genbank中的收录号为 CP003265(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/451779298 ? from = 1437173&to =1437895&sat = 4&sat_key = 105780430&report = fasta)，其基因序列如 SEQ ID NO: 1所示。由该基因编码的羰基还原酶，包含240个氨基酸，其在Genbank中的收 录号为 NP_441203(http://www.ncbi. nlm. nih. gov/protein/16330475 ? report = genbank&log$ = protalign&blast_rank = l&RID = 8AV63XPF01R)，其氨基酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。
[0010] 葡萄糖脱氢酶⑶H基因含有783bp碱基，其在Genbank中的收录号为 M12276(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/142954 ? from = 71&to = 853&sat = 4&sat_key = 42714303&report = fasta)，其基因序列如 SEQ ID N0:3 所不。由该基因编 码的羰基还原酶，包含260个氨基酸，其在Genbank中的收录号为AAA22463(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/142955 ? report = genbank&log$ = protalign&blast_rank =l&RID = 8CKY4132015)，其基因序列如 SEQ ID N0:4 所示。
[0011] 所述重组大肠杆菌能够同时表达羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶。
[0012] 本发明首先分别从pET-28a-SrCR和pET-28a-GDH载体中克隆出带有SD序列的基 因片段SD-SrCR和SD-GDH，构建出双酶耦合表达系统pET-28a-SrCR-GDH，然后将所述双酶 耦合表达系统转入大肠杆菌中，制得一种可不对称转化制备（S) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯的 重组大肠杆菌。
[0013] 本发明还提供一种如上所述的重组大肠杆菌在4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原制 备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
[0014] 本发明还提供一种制备（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。
[0015] 该方法包括：采用如上所述的重组大肠杆菌，以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物，并以 葡萄糖为辅助底物，以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)为辅因子，进行不对称还 原反应将所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯转化成（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
[0016] 所述方法中不需要额外添加辅酶。
[0017] 所述方法还包括向该反应体系中引入大孔吸附树脂以实现原位底物、产物移除， 从而减弱反应体系中底物抑制和产物抑制。所述大孔吸附树脂可以是HZ814、HZ816、XAD4、 XAD1180、XAD7HP中的一种，但是最优选为HZ814,经过多次实验验证该树脂的效果最好，得 到的底物转化率最高。
[0018] 所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为20mM~3000mM，葡萄糖的初始反 应浓度为35mM~4500mM。
[0019] 优选地，所述底物4-氯乙酰乙酸乙酯的初始反应浓度为400mM~lOOOmM，葡萄糖 的初始反应浓度为600mM~1500mM。
[0020] 所述不对称还原反应采用水相系统转化法。虽然现有技术中两相法和单水相催化 都比较普遍，相比较而言单水相催化避免了大量有机试剂对催化剂的毒害作用，有助于提 高反应效率，而本发明通过加入树脂可以有效地解决单水相反应中产物/底物浓度过高导 致的产物/底物抑制原位移除产物抑制和底物抑制。
[0021] 所述重组大肠杆菌以冻干菌体形式提供。
[0022] 优选地，所述重组大肠杆菌悬浮于pH 6. 5~7. 5的磷酸缓冲溶液中进行所述不对 称还原反应。
[0023] 本发明人通过在微生物法生产（S)-4_氯-3-羟基丁酸乙酯领域中进行大量的 研宄，通过基因组探矿技术从集胞藻细胞中获得了一条能够催化底物COBE的还原酶基因 (SrCR)，并结合从枯草芽孢杆菌中获得的葡萄糖脱氢酶基因（GDH)，将这两段基因构建到 同一载体质粒中，并成功在大肠杆菌中进行了高活性表达，经过发酵和催化反应研宄，证 实了该羰基还原酶能够应用于高活性和高选择性地催化COBE生成（S) -CHBE，其酶活高达 33. lU/mg，达到文献报导最高水平。通过使用大孔吸附树脂，特别是HZ814,原位移除底物、 产物抑制，使最终产物（S) -CHBE的积累量可达3000mM，最终底物转化率高达100 %，产物光 学纯度e. e%最尚可达99. 4%，相比现有技术均有了显者的提尚。
【附图说明】
[0024] 图1是本发明的重组共表达载体pET28a-SsCR-GDH的物理图谱。
[0025] 图2是电泳图谱，其中，泳道1为蛋白质分子量标准，泳道2示出了本发明的纯化 后羰基还原酶的SDS-PAGE电泳条带。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0027] 实施例1 :重组大肠杆菌的构建
[0028] 1、羰基还原酶基因的获取：
[0029] 蓝细菌 Synechocystis sp. PCC 6803 (购于 Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria)，培养基 Zobell 2216E(g ? I/1):蛋白胨 5g，酵母膏 lg，磷酸高铁 0? lg，陈 海水 1000mL，pH 7. 6。
[0030] 将蓝细菌 Synechocystis sp. PCC 6803 接种于 4mL Zobell 2216E 液体培养基中 25°C至对数生长期，使用基因组DNA提取试剂盒（上海捷瑞公司细菌基因组提取试剂盒） 提取基因组。
[0031] 构建表达载体所用的引物加设酶切位点，引物序列如下：
[0032] 上游引物（SrCR-F 含 Bam HI)为：AACGCGGATCCATGTTAAGTCTT GGITTGGAAG，下游引 物（SrCR-R含Hindlll)为：AACCCAAGCTTAGGTGTGGTGGGCCCCAITT，所有引物均由上海捷瑞公 司合成。
[0033] 东洋纺 K0D 酶 PCR 反应体系为：H20 32. 5ul、缓冲液 5ul、2_ dNTP 5ul、 MgCl22. 5ul、模板2ul、20mM F/R引物lul、KOD酶lul。琼脂糖凝胶电泳确认条带大小正确 后，使用天根公司胶回收纯化试剂盒回收扩增得到的基因。随后，使用Fermentas公司内切 酶BamHI和HindIII切割基因末端获得有悬挂末端