一种具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域和环境保护领域，特别涉及一种具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌。
【背景技术】
[0002]木质纤维素是自然界中最丰富的生物质资源，由木质素、纤维素和半纤维素通过氢键和共价键等相互作用交织在一起，形成高度复杂的木质纤维素结构，难以被微生物分解，从而降低了木质纤维素资源的利用效率。为了加速木质纤维素类资源的分解与利用，以崔宗均为代表的研宄团队在不破坏微生物协同关系的情况下，采用长期限制性外淘汰法，筛选出多组具有稳定木质纤维素降解能力的复合菌，对于解决秸杆还田腐熟速度慢，推动木质纤维素类物质的资源化利用研宄有积极作用。
[0003]有机氯酚作为一种重要的化工原料和工业环节的中间产物(如纺织、造纸、印染等)，被广泛用于杀虫剂、除草剂、防腐剂和染料中间体等，并通过喷施、挥发、泄露、排放和燃烧等途径进入环境。为有效降解残留于环境中的有机氯酚，陆光华等从活性污泥中筛选驯化得到一组具有降解4-氯酚、4-硝基苯酚和2，4，6-三氯酚的复合菌，在治理受酚类物质污染的河道中有较好效果，并能与环境中的微生物有共代谢作用。
[0004]然而随着科技发展，环境污染也越显交错复杂，作为终端污染产物的固体废弃物，不仅包含了原料中难以降解的木质纤维素，同时还富集了加工等过程中可能残留的有机污染物，例如造纸污泥，不仅富含细小纤维、木质素及其衍生物、糖类和盐，还富集浓缩了制浆中残余木素在氯化漂白过程中形成大量的有机氯化物。有机氯化物具有典型的“三致”特性(致畸、致癌、致突变)。将含有有机氯化物的污染物(如造纸污泥等)直接农用将会给土壤和作物带来外源有机污染，给生化处理系统的微生物带来毒害。如何有效降解污染物中的有机氯酚，同时实现木质纤维素和有机氯酚的高效转化是提升富含木质纤维素和有机氯酚类污染物(如造纸污泥等)资源化利用价值的关键，而筛选具有协同降解木质纤维素和有机氯酚功能的微生物菌种又成为解决前述问题的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的首要目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌的制备方法。
[0006]本发明的另一目的在于提供由上述制备方法得到的具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌的制备方法，包括如下步骤:
[0008](I)将滤纸和有机氯酚储备液加入不灭菌的液体培养液中，加入蘑菇渣进行第一阶段筛选驯化，在滤纸出现断裂和碎化时进行下一代转接，得到具有纤维素和有机氯酚降解能力的两组复合菌?’每10mL不灭菌的液体培养液添加4g蘑菇渣；筛选第一阶段培养液的添加量为150mL，每10mL不灭菌的液体培养液添加Ig滤纸；每150mL不灭菌的液体培养液添加50 μ L有机氯酚储备液；筛选驯化过程中微生物的接种量为10% (V/V)，继代培养驯化30-35代；
[0009](2)将步骤⑴中经筛选驯化的具有纤维素和有机氯酚降解能力的两组复合菌共混后转接到含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液中进行第二阶段筛选驯化，在水稻秸杆分解成丝状时进行下一代转接，得到具有木质纤维素和有机氯酚降解能力的复合菌OEMl ?’每10mL含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液添加0.5g水稻秸杆；筛选第二阶段含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液的添加量为100mL，每10mL含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液添加50 μ L有机氯酚储备液；筛选驯化过程中菌液的接种量为10% (V/V)，继代培养驯化10-15代；
[0010]步骤(I)中，
[0011]所述的滤纸为市售定性滤纸，优选裁剪成长宽为6cmX Icm ；
[0012]所述的有机氯酚储备液为15% (W/V)的混合有机氯酚储备液；
[0013]所述的有机氯酚优选为邻氯苯酚、2，4- 二氯酚和2，4，6-三氯酚，邻氯苯酚、2, 4- 二氯酸和2，4, 6- 二氯酸的质量比为1:1:1。
[0014]所述的不灭菌的液体培养液采用如下方法制备:取蛋白胨2.5g，Na2HPO4L 5g，KH2PO4L 5g，MgCl2.6H20 0.8g，CaCl2.2H20 0.8g，酵母膏 0.8g，微量元素 lmL/L，加蒸馏水定容至1000mL，摇匀，得到不灭菌的液体培养液；
[0015]所述的微量元素采用如下方法制备:取MnCl2.4H20 0.lg, CoCl2.6H20 0.17g，ZnCl20.10g，CaCl20.20g，H3BO40.019g，NiCl2.6H20 0.05g，Na2MoO4.2H200.020g，CuSO4.5H200.lg，加蒸馏水至1000mL，用氢氧化钠调节pH值至中性，得到微量元素。
[0016]所述的蘑菇渣为蘑菇培植后遗弃的生长基质，将蘑菇渣作为木质纤维素和有机氯酚降解的初始菌种来源添加到筛选体系中；
[0017]所述的蘑菇为平菇、杏鲍菇或草菇中的至少一种。
[0018]步骤⑵中，
[0019]所述的水稻秸杆优选采用如下方法进行处理:将水稻秸杆用I %氢氧化钠溶液浸泡I天后，用自来水冲洗至中性，烘干，剪成0.3-0.5cm长。
[0020]一种具有木质纤维素和有机氯酚降解能力的复合菌0EM1，由上述制备方法得到。
[0021]所述的具有木质纤维素和有机氯酚降解能力的复合菌OEMl以30%的甘油保存，置于-80°C冰箱保存。
[0022]所述的复合菌OEMl可以应用于降解木质纤维素和有机氯酚。
[0023]优选的，所述的复合菌OEMl应用于降解含有0.5-4.0 %木质纤维素和50_75mg/L有机氯酚的底物。
[0024]所述的降解的条件优选为于28°C、120r/min、降解12d。
[0025]所述的复合菌OEMl应用于降解木质纤维素和有机氯酚时，活化两代，降解时复合菌OEMl的接种量为10% (V/V)。
[0026]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0027](I)本发明以木质纤维素和有机氯酚为目标降解底物，蘑菇渣为菌种来源，筛选构建出了一组在常温好氧条件下具有高效降解木质纤维素和有机氯酚功能的复合菌0EM1，并通过降解水稻秸杆和有机氯酚试验，验证该复合菌的降解木质纤维素和有机氯酚的效能及功能稳定性。
[0028](2)本发明针对目前工业固体废物(如造纸污泥等)不仅包含了生产原料中剩余的难降解的木质纤维素，同时还富集了加工等过程中可能残留的有机氯化物，如何高效降解固体废弃物中残留的木质纤维素和有机氯化物成为其资源化利用的关键。该发明提供了解决富含木质纤维素和有机氯化物环境污染及其实现资源化利用关键问题的途径，实现了木质纤维素和有机氯化物高效协同降解，具有开发新的木质纤维素和有机氯化物高效降解复合菌资源、促进微生物生态学的发展、防止含有木质纤维素或有机氯化物的工业废弃物如造纸污泥的环境污染及提高其资源化利用率的重要意义。
[0029](3)本发明的筛选流程简单，可操作性强；得到的复合菌OEMl组成及性质稳定，可以高效降解纤维素、半纤维素和木质素，同时有效降解有机氯酚。
【附图说明】
[0030]图1为实施例2的复合菌OEMl对水稻秸杆的降解结果；
[0031]图2为实施例2的复合菌OEMl对纤维素、半纤维素和木质素的降解结果；
[0032]图3为实施例2的复合菌OEMl对有机氯酚的降解结果；
[0033]图4为实施例2的复合菌OEMl降解木质纤维素和有机氯酚过程中pH值变化结果。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0035]实施例1
[0036]一种具有木质纤维素和有机氯酚协同降解功能的复合菌的制备方法，包括如下步骤:
[0037](I)将滤纸和有机氯酚储备液加入不灭菌的液体培养液中，加入蘑菇渣进行第一阶段筛选驯化，在滤纸出现明显断裂和碎化时进行下一代转接，得到具有纤维素和有机氯酚降解能力的两组复合菌?’每10mL不灭菌的液体培养液添加4g蘑菇渣；筛选第一阶段不灭菌的液体培养液的添加量为150mL，每10mL不灭菌的液体培养液添加Ig滤纸；每150mL不灭菌的液体培养液添加50 μ L有机氯酚储备液；筛选驯化过程中微生物的接种量为10%(V/V)，继代培养驯化30-35代；
[0038](2)将步骤⑴中经筛选驯化的具有纤维素和有机氯酚降解能力的两组复合菌共混后转接到含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液中进行第二阶段筛选驯化，在水稻秸杆分解成丝状时进行下一代转接，得到具有木质纤维素和有机氯酚降解能力的复合菌OEMl ?’每10mL含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液添加0.5g水稻秸杆；筛选第二阶段含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液的添加量为100mL，每10mL含有水稻秸杆和有机氯酚的不灭菌的液体培养液添加50 μ L有机氯酚储备液；筛选驯化过程中菌液的接种量为10% (V/V)，继代培养驯化10-15代；
[0039]步骤(I)中，
[0040]所述的滤纸为市售定