诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂、培养基的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种诱导胚胎干细胞定向分化的诱导剂，尤其涉及一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂、培养基及方法。
【背景技术】
[0002]口腔黏膜是人体抵御外界各种有害因子的第一道屏障，具有保护口腔黏膜下各种组织、感觉、温度调节及分泌等十分重要的功能。由于牙周手术、义齿修复前外科手术、牙种植术、先天或后天面部畸形修复手术、创伤和肿瘤切除等可能引起口腔黏膜组织的缺损或功能不全，往往需要进行口腔黏膜组织重建。目前临床广泛采用自体皮肤移植或口腔黏膜瓣移植修复缺损。但是移植皮肤多年后仍保持皮肤上皮原有结构功能和角化、分泌、毛发生长等特征，缺乏正常黏膜的潮湿滑润感，使患者倍感不适，远远不能满足临床需要，从而限制了临床应用。而且上述方法都要开辟第二手术野，会给患者带来新的创伤和痛苦。因此，寻找一种理想的口腔黏膜替代物是临床上急需解决的难题。
[0003]口腔黏膜上皮属复层鳞状上皮，以角化细胞为主。诱导胚胎干细胞(hESC)定向分化为角化细胞的关键是在hESC分化初期阻止其向神经细胞方向分化，通过合适的诱导剂诱导形成角化细胞祖细胞，并进一步分化，维持上皮细胞的表型。现有技术主要是采用不同组分的诱导剂，如单独使用骨形成蛋4 (bone morphogenetic protein 4,BMP4)、单独使用抗坏血酸(ascorbic acid, AA)、联合使用BMP4和维甲酸(retinoic acid, RA)、联合使用BMP4和AA，采用这些配方的诱导剂诱导第35天时细胞角蛋白14的表达率分别为5.4%、8.9%,35%和59%。这些细胞在表型维持，筛选纯化，终末分化等方面仍显不足，需要进一步优化诱导分化方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂、培养基及方法，能够有效提高hESC定向诱导分化为角化细胞的效率，为组织工程化口腔黏膜构建提供种子细胞。
[0005]本发明的第一个方面是提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂，所述诱导剂包含骨形成蛋白4 (BMP4)、维甲酸(RA)和抗坏血酸(AA)。
[0006]在一个优选的实施方式中，所述诱导剂中，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(l-50g): (0.l-5mol): (50_600mol)。
[0007]进一步优选地，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(5_45g):(0.2-4.5mol): (100-500mol)。
[0008]进一步优选地，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(10-40g):(0.4-4mol): (150_450mol)。
[0009]进一步优选地，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(20_35g):(0.5-3mol): (200-400mol)。
[0010]进一步优选地，骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸的含量比为(25-30g):(l-2mol): (250-350mol)。
[0011]本发明的第二个方面是提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基，所述培养基含有上述第一个方面所述的诱导剂。
[0012]在一个优选的实施方式中，所述诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基中含有:
[0013]骨形成蛋白41-50ng/ml,更优选为5_45ng/ml,更优选为10_40ng/ml,更优选为20_35ng/ml,更优选为 20_35ng/ml ；
[0014]维甲酸0.l_5uM，更优选为0.2-4.5uM，更优选为0.4_4uM，更优选为0.5_3uM，更优选为l-2uM ；
[0015]抗坏血酸0.05-0.Bmmol /I,,更优选为 0.1-0.Smmol /I,,更优选为 0.15-0.45mmol/L,更优选为 0.2-0.4mmol/L,更优选为 0.25-0.35mmol/L,例如 0.3mmol/L、0.32mmol/L 或0.28mmol/L0
[0016]在一个优选的实施方式中，所述诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基包括用于胚胎干细胞培养的分化培养基。
[0017]优选地，所述的用于胚胎干细胞培养的分化培养基含有DMEM/F12培养液和N2添加剂:
[0018]DMEM/F12培养液的体积百分比浓度为95-99.9%,更优选为96-99.5%, 97-99.2t%,98—99% ；
[0019]N2添加剂的体积百分比浓度为0.1-5%，更优选为0.5-4%,更优选为0.8-3%,更优选为1-2%。
[0020]在一个进一步优选的实施方式中，所述诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基按照下述方法配制而成:将本发明第一个方面所述的诱导剂加入到所述的用于胚胎干细胞培养的分化培养基中。
[0021]本发明的第三个方面是提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的方法，采用权利要求4-7中任意一项所述的诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基，包括以下步骤:
[0022]步骤1，采用传代后胚胎干细胞(优选为传代后第2-7天的细胞，例如传代后第3天、第4天、第5天或第6天的细胞)在权利要求4-7中任意一项所述的培养基诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的中贴壁培养5-10日(优选为6-9日，更优选为7-8日)，每日换液。
[0023]在一个优选的实施方式中，还包括前处理步骤:将胚胎干细胞株在培养基中进行培养，传代。
[0024]在一个优选的实施方式中，还包括后处理步骤:将步骤I处理得到的细胞以中性蛋白酶消化后，接种至I型胶原包被的培养皿中，以角化细胞培养液继续贴壁培养3-6周(更优选为4-5周)，隔日换液，在细胞对数生长期传代。
[0025]本发明提供的诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂，复合了骨形成蛋白4、维甲酸和抗坏血酸，能够有效提高hESC定向诱导分化为角化细胞的效率(角蛋白14表达率高达77.93%，远远高于其他配方诱导剂)提供了一条高效诱导hESC向角化细胞分化的途径，为组织工程化口腔黏膜构建提供种子细胞。
【附图说明】
[0026]图1为hESC经本发明提供的诱导剂诱导分化后的单次形态学检测结果；
[0027]图2为hESC经本发明提供的诱导剂诱导分化后单次流氏细胞检测结果；
[0028]图3为hESC经本发明提供的诱导剂诱导分化后单次免疫荧光染色结果。
【具体实施方式】
[0029]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
[0030]1.hESC的常规培养:本研究采用国际卫生组织注册的H9人胚胎干细胞株(agreement n0.11-W0039, WiCell Research Institute, Madison, WI)0 hESC 在基质胶上以mTeSRl培养基培养，5天传代。
[0031]1.hESC的常规培养:本研究采用国际卫生组织注册的H9人胚胎干细胞株(agreement n0.11-W0039, WiCell Research Institute, Madison, WI)0 hESC 在基质胶上以mTeSRl培养基培养，5天传代。
[0032]2.hESC向角化细胞诱导方案:
[0033]2.1实验组诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基的配制:将本发明提供的诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的诱导剂加入到用于胚胎干细胞培养的分化培养基中既得，其中，所述诱导胚胎干细胞定向分化为角化细胞的培养基中含有: