专利名称：诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂及培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂、诱导分化培养基及其应用。
背景技术：
由心肌细胞功能障碍引起的心脏衰竭是世界范围内的一种主要的疾病，心衰患者最终死亡的原因主要是心脏泵血功能丧失或心律不齐。严重的心衰患者一年期死亡率超过50%。虽然晚期患者可以进行心脏移植，然而由于供体器官缺乏，约有20%的病人在等待器官移植的过程中死亡。由于心力衰竭的高发病率和死亡率、移植心脏的死亡、免疫排斥反应等并发症以及移植心脏后期失效等客观现状，亟待发展新的治疗方法以提高心肌细胞的功能，阻止心力衰竭的发生。目前对心力衰竭的治疗方法主要集中于早期血管再生和抑制进 一步的心肌细胞损失，而心肌细胞是一种终端分化的细胞，增殖能力极其有限，损失后极难恢复。而心肌细胞移植疗法着重于重建心肌功能，恢复再生心肌组织的泵血能力，也有研究发现注入心脏的心肌细胞能够形成新的心肌组织。但细胞移植治疗关键因素是确定合适的供体细胞类型。因此，如何诱导干细胞定向分化为心肌细胞以用于医药治疗是亟待解决的技术难题。目前用于心肌细胞定向分化的主要分化方法、诱导剂及分化发生的可能机制如下1.自主分化
人胚胎干细胞(hESC)脱离滋养层细胞在体外悬浮培养10天形成EBs后贴壁培养4天后8. l%EBs出现自主收缩。具体分子机制仍不清楚，可能和细胞株类型、血清中的某些细胞因子、培养方式等因素有关。此种方法无需干预，但分化率极低，不能满足为细胞移植提供供体的最终目的。2.药物诱导
现在可以用作诱导剂的药物有抗坏血酸C、维甲酸(retinoic acid, RA)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)、5_ 氮 _2_ 脱氧胞苷(5-aza-2_deoxycytidine, 5-aza-dC)
坐寸o此方法可以诱导胚胎干细胞向功能性心肌细胞分化，但多数现在应用的诱导剂均具有生物毒性，不适宜应用于临床。维生素C (维甲酸)虽已广泛应用于临床，但也有报道长期过量服用可能导致草酸及尿酸结石，结石病人的使用受到局限。3.生理活性物质
骨形成蛋白、催产素等生理活性物质本身在体内即具有重要的生理活性，体外研究可以很好的应用，但应用于临床时具有一定的局限性。4.共培养方法
禽类的心前内胚层/中胚层和mESC共培养、END-2细胞系和hESC共培养均可诱使胚胎干细胞向心肌细胞分化。此种方法的诱导分化机制是仿照生物发育调控机制中的胚胎诱导方式，分泌多种细胞因子，诱导ESC向中胚层心肌细胞方向分化。此方法可以模拟体内干细胞的生存环境，不需要添加额外的诱导制剂，但对分化过程的调控及分离最终的功能细胞比较困难。5.转基因的方式
目前的方法有转染Nkx2. 5基因，心肌特异性a肌球蛋白重链启动子和增强绿色荧光蛋白标记基因联合转染，转染a肌球蛋白启动子联合嘌呤毒素抗性基因、表皮生长因子基因和增强绿色荧光蛋白标记基因。该方法的机理是通过上调心肌细胞相关的特异性基因，激活心脏发育相关的信号传导通路，诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化。
转基因安全性是需要首先考虑的问题之一，要做到这一点，必须使转基因能在特定细胞中的表达受到精确的控制，表达过多过少均不能达到预期的效果。
发明内容
本发明所要要解决的技术问题干细胞移植是一种新型治疗手段，对于心肌梗死和心力衰竭的患者来说，如果能够使移植的干细胞有效分化为心肌细胞则可以显著改善其预后。多数干细胞诱导剂由于具有细胞毒性或体内作用不可控而仅仅应用在干细胞体外实验中，这对进一步提高干细胞移植疗效提出了挑战。如经典的干细胞诱导剂5-氮胞苷是一种去甲基化药物，它可使控制向心肌分化的特定调控基因阻遏蛋白去甲基化而发生构型改变，从而促进干细胞向心肌细胞分化。在5-氮胞苷的基础上加入一些生长因子则能进一步提高分化效率，但由于具有较大毒性，很难应用于临床。为了解决上述技术问题，本发明提供一种诱导剂具有诱导胚胎干细胞定向分化的作用，诱导分化后的功能心肌细胞可为心肌细胞移植疗法提供合适的细胞供体。本发明的诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂，含有丹酚酸B。其中，所述的诱导剂，还可含有人参皂苷Rgl。其中，所述的诱导剂，还可含有人参总皂苷。本发明提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求1所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10-卜10_3M0优选地，所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基由如下成分配制而成GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，其中GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77.9:20:1:1:0.1。本发明还提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求2所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10-卜10_3M，人参皂苷Rgl在所述诱导分化培养基中的浓度为5 X 10_6 10_3M。优选地，所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基由如下成分配制而成=GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，其中GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77. 9:20:1:1:0.1。
本发明另提供一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求3所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10_6 10_3M，人参总皂苷在所述诱导分化培养基中的浓度为7.8iig/mL 1.5mg/mL。优选地，所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基由如下成分配制而成=GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，其中GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77.9:20:1:1:0.1。 上述的诱导剂在诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的应用，包括胚胎干细胞体外培养形成拟胚体，取拟胚体于含有所述诱导剂的诱导分化培养基中，进行诱导分化培养，获得心肌细胞。上述的诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的应用，包括
1)将胚胎干细胞制成单细胞悬液；
2)悬滴培养将单细胞悬液细胞计数后用分化培养基将其稀释成细胞浓度为10，105cellS/mL的胚胎干细胞悬液，接种于细菌培养皿的盖子内表面上，翻转培养皿盖子，使盖子上的胚胎干细胞形成悬滴，培养皿中加入水或水溶液以保持悬滴在孵育过程中的湿度，培养皿置于5%C02，37°C培养箱中培养f 3天；
3)悬浮培养收集步骤2)培养皿盖子上悬滴中形成的拟胚体，将其转移到盛有分化培养基的细菌培养皿中，放入培养箱中继续悬浮，促使拟胚体进一步增殖；
4)将步骤3)制备好的拟胚体转移到明胶包被的孔板，每孔一个拟胚体添加所述诱导分化培养基，开始干预分化培养。优选地，步骤2)和步骤3)中所述分化培养基由如下成分配制而成GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，其中，GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77.9:20:1:1:0.1。本发明能够达到以下技术效果1、提供一种诱导剂及含该诱导剂的培养基，其无毒，具有诱导胚胎干细胞定向分化的作用，诱导分化后的功能心肌细胞可为心肌细胞移植疗法提供合适的细胞供体。2、开拓了丹酚酸B的新用途，S卩，诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞。3、人参总皂苷或人参皂苷Rgl与丹酚酸B联合的新用途，即，诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞。4、经实验选出了丹酚酸B、人参总皂苷或人参皂苷Rgl在培养基中的浓度，在此浓度下能够促进诱导定向分化。5.丹酚酸B不仅本身对心血管疾病具有很好的疗效，用丹酚酸诱导胚胎干细胞分化可弥补维生素C应用的不足。
图1是丹酚酸B对ES细胞体外增殖的影响。图2显示丹酚酸B诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。
图3显示心肌特异性蛋白P-MHC和TnI的表达水平。图4是实施例1胚胎干细胞源的心肌细胞特异性蛋白TnT，a -Actinin (X400)免疫荧光阳性表达结果。A. DAPI染色心肌细胞细胞核；B.抗TnT抗体阳性表达；C. AB重叠图；D. DAPI染色心肌细胞细胞核；E.抗a-Actinin抗体阳性表达；F. DE重叠图。图5显示丹酚酸B及阳性对照Vc诱导心肌细胞分化过程中心肌特异性转录因子和心肌特异性基因的表达水平。图6丹酚酸B诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的时一效关系。
图7是丹酚酸B和人参皂苷Rgl对ES细胞体外增殖的影响。图8显示丹酚酸B和人参皂苷Rgl诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。图9是实施例2胚胎干细胞源的心肌细胞特异性蛋白TnT，a -Actinin (X400)免疫荧光阳性表达结果。图10是丹酚酸B和人参总皂苷对ES细胞体外增殖的影响。图11显示丹酚酸B和人参总皂苷诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的分化率。图12是实施例3胚胎干细胞源的心肌细胞特异性蛋白TnT，a -Actinin (X400)免疫荧光阳性表达结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例1:丹酚酸B诱导胚胎干细胞CGR8定向分化为心肌细胞1、丹酚酸B影响胚胎干细胞的增殖活性
细胞株小鼠胚胎干细胞系 CGR8 (129/Ola-derived wild-type ES cells, ATCC)0主要实验试剂GMEM培养基；特级胎牛血清(FBS);小鼠白血病抑制因子(Leukaemia Inhibitory Factor, LIF)。正常培养的CGR8消化计数后调整细胞悬液浓度为3X IO3 cells/mL。将该细胞悬液以每孔200 ii L加入96孔培养板，在培养箱中孵育2小时，待ES细胞贴壁后添加含有丹酚酸B的完全培养基(构成见表I)培养，完全培养基中丹酚酸B的浓度范围为IO-3IO-6M,以不含丹酚酸B的完全培养基为对照组。培养3天后采用MTT法检测ES细胞增殖活性。以增殖率评价不同丹酚酸B浓度对ES细胞体外增殖的影响，增殖率的计算方法为OD (加药组)/ OD (对照组)。其中，完全培养基的配制方法1)取GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，混合，其中，GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77. 9:20:1:1:0.1。2)加入LIF，使LIF在完全培养基中的浓度为1000U/mL。如下表I所示。表I完全培养基的构成nisn
GMEM^JmLSigma G614S
舱牛Jr清(FBS)20 uiLGibco 10099-141
非必频氨基酸1mLGibco 11140-050
(XEAA)
I OOmM的丙酸钠1 mLGibco 11360-0—0
水溶液(SodkrnPymvate) ICHM的二巯基乙CLlmLWako etc
醇水濬液(2-入正)
ICfUmLLff0—OlmLESGRO
将不同浓度的丹酚酸B溶于完全培养基中。在一定的浓度范围内，丹酚酸B促进胚胎干细胞CGR8的增殖。完全培养基中10_3M浓度的丹酚酸B作用时，对CGR8细胞的生长已具有明显的抑制作用，抑制率达约70%左右，10_4M浓度的丹酚酸B对胚胎干细胞的增殖也具有一定的抑制作用，但胚胎干细胞分化过程伴随着干细胞增殖能力的减弱，也就是对干细胞有一定抑制作用并不一定会对细胞的诱导分化有不良影响，甚至可能会促进诱导分化，因此即使在某些浓度下有抑制增殖的作用，但是仍可用于诱导分化。浓度低于KT6M的丹酚酸B不会抑制干细胞的增殖，但是浓度过低会影响其分化结果。综合以上，丹酚酸B分化的浓度范围选择10_6-10_3M。培养基中不同浓度的丹酚酸B对干细胞增殖的测定结果见图1所示。2.丹酚酸B诱导胚胎干细胞CGR8向心肌细胞分化过程
将CGR8细胞制成单细胞悬液后经三步法制备拟胚体(embryoid bodys, EBs),三步法的简要过程①悬滴培养将单细胞悬液细胞计数后用分化培养基(构成见表2)将其稀释成细胞浓度为5X IO4ceIlsAiL的ES细胞悬液。以每滴20uL的体积接种于细菌培养皿的盖子内表面上，轻轻翻转培养皿盖子，使盖子上的ES细胞形成悬滴，培养皿中加入适量PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)以保持悬滴在孵育过程中的湿度，置于5% CO2, 37°C培养箱中培养2天。②悬浮培养收集培养皿盖子上悬滴中行程的拟胚体，将其转移到盛有IOml分化培养基的粘附力低的细菌培养皿中，放入培养箱中继续悬浮2天，促使EBs进一步增殖。③将制备好的EBs转移到明胶包被的24孔板，每孔一个EB并添加诱导分化培养基(即含有丹酚酸B的分化培养基)，进行丹酚酸B干预分化培养。丹酚酸B的作用浓度在5X10」 KT5M的浓度内选择5X10_2、1(T3M、1(T4M、5X 10_4M、10_5M及10_6为作用浓度；选用10_4M的维生素C (Vc)为阳性对照药；阴性对照选用不添加任何药物的分化培养基。每天更换分化培养基，同时每天镜检EB，以观察EB出现搏动心肌细胞簇的时间和搏动特征。其中，分化培养基的制备方法取GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，混合，其中，GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77. 9:20:1:1:0.1。如下表2所示。表2分化培养基的构成
权利要求
1.一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂，其特征在于，含有丹酚酸B。
2.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，还含有人参皂苷Rgl。
3.根据权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，还含有人参总皂苷。
4.一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求1所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10-卜10_3 M0
5.根据权利要求4所述的诱导分化培养基，其特征在于，所述用于胚胎干细胞培养的分化培养基由如下成分配制而成=GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M的二巯基乙醇水溶液，其中GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液二巯基乙醇水溶液的体积比=77. 9:20:1:1:0.10
6.一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求2所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10-卜10_3 M，人参皂苷Rgl在所述诱导分化培养基中的浓度为5X 10_6 H
7.一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基通过以下方法制得将权利要求3所述的诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为lotion， 人参总皂苷在所述诱导分化培养基中的浓度为7. 8μ g/mL l. 5mg/mL。
8.权利要求Γ3任一项所述的诱导剂在诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的应用，其特征在于，包括胚胎干细胞体外培养形成拟胚体，取拟胚体于含有所述诱导剂的诱导分化培养基中，进行诱导分化培养，获得心肌细胞。
9.权利要求Γ7任一项所述的诱导分化培养基在诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的应用，其特征在于，包括1)将胚胎干细胞制成单细胞悬液；2)悬滴培养将单细胞悬液细胞计数后用分化培养基将其稀释成细胞浓度为 10，105cellS/mL的胚胎干细胞悬液，接种于细菌培养皿的盖子内表面上，翻转培养皿盖子， 使盖子上的胚胎干细胞形成悬滴，培养皿中加入水或水溶液以保持悬滴在孵育过程中的湿度，培养皿置于5% CO2, 37°C培养箱中培养f 3天；3)悬浮培养收集步骤2)培养皿盖子上悬滴中形成的拟胚体，将其转移到盛有分化培养基的细菌培养皿中，放入培养箱中继续悬浮，促使拟胚体进一步增殖；4)将步骤3)制备好的拟胚体转移到明胶包被的孔板，每孔一个拟胚体添加所述诱导分化培养基，开始干预分化培养。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤2)和步骤3)中所述分化培养基由如下成分配制而成=GMEM培养基，胎牛血清，非必须氨基酸，IOOmM的丙酮酸钠水溶液和KT1M 的二巯基乙醇水溶液，其中，GMEM培养基胎牛血清非必需氨基酸丙酮酸钠水溶液 二巯基乙醇水溶液的体积比=77. 9:20:1:1:0.10
全文摘要
本发明公开了一种诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的诱导剂及培养基。该诱导剂，含有丹酚酸B。该培养基通过以下方法制得将该诱导剂加入用于胚胎干细胞培养的分化培养基；其中，所述诱导剂中的丹酚酸B在所述诱导分化培养基中的浓度为10-6~10-3M。本发明还公开了该诱导剂和该培养基在诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞中的应用。本发明的诱导剂，无毒，具有诱导胚胎干细胞定向分化的作用，诱导分化后的功能心肌细胞可为心肌细胞移植疗法提供合适的细胞供体。
文档编号C12N5/02GK102994446SQ201210512048
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者罗国安, 王义明 申请人:罗国安