专利名称：一种棒状链霉菌的工程菌株及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种棒状链霉菌的紫外诱变及基因阻断突变菌及其制备方法。
背景技术：
几十年来，由于抗生素的大量使用，导致了细菌对很多药物的抗药性，病原菌对β 一内酰胺类抗生素的耐药性，己成为临床上难治性感染的重要因素之一。克拉维酸(clavulanicacid)是棒状链霉菌clavuligerus')饱氏 谢产物，又名棒酸，是第一个被发现并应用于临床的β_内酰胺酶抑制剂。克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它具有强力、广谱且不可逆的β_内酰胺酶抑制活性。克拉维酸与β_内酰胺类抗生素如阿莫西林(Amoxicillin)、替卡西林(Ticarcillin)分别联合,制成酶抑制剂联合制剂，可在不同程度上保护β -内酰胺类抗生素不被β -内酰胺酶灭活，从而提高该抗生素对产酶耐药菌的抗菌活性，提高临床疗效。棒状链霉菌中头霉素C的合成代谢途径是以L-赖氨酸、L-半胱氨酸和缬氨酸为前体物质的。棒状链霉菌的hi基因编码赖氨酸转氨酶(该酶是头霉素C合成途径中的关键酶)，是牵涉到头霉素C合成的第一个基因，也是进行调控的首选基因。研究表明，棒状链霉菌中一种代谢产物的阻断可能导致其它代谢产物产量的提高。克拉维酸基因簇和头霉素C基因簇相邻,且受相同的调节蛋白CcaR的调控,Paradkar等(Paradkar AS, MosherRH, Anders C (2001). Application of gene replacement technology to Streptomycesclavuligerus strain development for clavulanic acid production. App1. Environ.Microbiol. , 67(5) : 2292-2297.)研究表明，在发酵过程中降低或消除棒状链霉菌中头霉素C的合成能够提高克拉维酸的产量，并可以有效减少发酵液中的干扰物质，简化提取工艺。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的棒状链霉菌克拉维酸产量低的不足，采用紫外诱变结合分子改造的方法对棒状链霉菌进行多方面改造，提供一种棒状链霉菌的高产工程菌株及其制备方法，该棒状链霉菌的突变菌株的克拉维酸产量得到较大提
1 O本发明的一个目的在于克服上述技术问题，从而提供一种棒状链霉菌突变株棒状链霉菌突变株Iat: : Δ {Streptomyces clavuligerus Iat: : Δ )菌株(保存的是最终产量最1 的菌株)。本发明所述的棒状链霉菌iStreptomyces clavuligerus)较佳的是棒状链霉菌{Strep tomyces cla vuligerus) NRRL3585。
本发明的另一个目的在于提供一种棒状链霉菌的紫外线诱变突变菌的方法。本发明的还一个目的在于提供一种棒状链霉菌突变株Iat: : Δ {Streptomycesclavuligerus Iat:: Δ)菌株在用于抗生素生产菌生产中的应用。所述的抗生素生产菌对象为产酶耐药菌。棒状链霉菌突变株Iat: : Δ (Sirepio焊Ce1S clavuligerus Iat: : Δ )菌株。该菌种是一种在获得的紫外诱变高产突变株为出发菌株的基础上，先将其hi基因的第191 1600位之间的核苷酸片段以一段安普抗性基因置换掉，再通过基因敲除技术去除安普抗性基因，获得不含有任何抗性标记的Iat基因敲除的突变菌株。菌落特征成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形。28°C培养3 5天后菌落表面生成暗灰绿色孢子，孢子成熟后易于刮下。菌丝特征气生菌丝为网状、白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。
根据本发明，所述的第安普抗性基因整合于本发明的棒状链霉菌的基因中。在基因中的整合位置是在基因组的任何位置，只要不影响菌株本身的生物合成，能够高产克拉维酸的情况，都在本发明的保护范围之内。本发明更加详细的说明如下
一、具体技术支撑
㈠微生物名称和保藏情况
棒状链霉菌Iat: : △菌株。该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为，保藏时间。㈡菌株的生物学特性及鉴定1.棒状链霉菌Iat: : Λ菌株的形态学特征
菌落特征成熟单菌落生长丰满，紧密，菌落呈草帽形。28°C培养3 5天后菌落表面生成暗灰绿色孢子，孢子成熟后易于刮下。菌丝特征气生菌丝为网状、白色，基内菌丝由浅黄到灰黄，都不产生可溶性色素。依据《菌物学大全》(裘维蕃，菌物学大全[M]·北京科学出版社，1998:890)和《常见与常用真菌》(中国科学院微生物研究所[M].北京科学出版社，1973)，该菌特征与枝顶孢霉特征相符，极似《常见与常用真菌》中所描述的顶头孢霉(Cephalosporiumacremonium.)。2.棒状链霉菌Iat: : Δ序列分析及鉴定结果
测序结果连接产物经转化后测序，由北京华大基因科技序列测定片段长度约为500bp,测序结果如下
序列提交到Gen-Bank数据库，进行BLAST比对，结果显示该菌株16S rDNA序列与棒状链霉菌同源性为100% (_)。结合形态学鉴定结果，将该菌确定为棒状链霉菌。本发明进一步公开了一种制备如上所述的任一棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的基因阻断突变菌的方法,包括以下步骤
(1)构建基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA；
(2)将基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA转化宿主细胞，获得转化子；
(3)构建基因内部被敲除的重组质粒pSCAR；
(4)将棒状链霉菌B372作为受体，与步骤(2)所述的转化子进行接合转移，获得接合子，即棒状链霉菌的Iat基因阻断突变菌51 clavuligerus lat: :aac。 (5)将棒状链霉菌5 clavuligerus lat: : aac作为受体，将步骤(3)所述的重组质粒P SCAR转入受体菌，获得不含有任何抗性标记的7a 基因敲除的突变菌株S. clavuligerus lat: : Δ。本发明中步骤(I)所述的构建基因中整合有安普抗性框的重组质粒pELA用于与棒状链霉菌的Iat基因发生同源双交换，从而得到基因中整合有安普抗性基因的棒状链霉菌的基因工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒PGH112，在该载体骨架中克隆有整合了安普抗性基因的被阻断的Iat基因ο本发明中步骤(2)所述的诱变条件较佳的是采用15W或30W紫外线，提前预热 20—30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20— 30cm处进行紫外照射30— 45秒，较佳的诱变对象为棒状链霉菌的孢子。本发明中步骤(3 )所述的构建的7a 基因内部被敲除的重组质粒pSCAR用于与棒状链霉菌的Iat基因被安普抗性基因置换的突变株发生同源双交换，从而得到Iat基因被敲除的无抗性标记的棒状链霉菌的基因工程菌。其中，在该重组穿梭载体中，所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒PGH112，在该载体骨架中克隆有被敲除中间区段的Iat基因，即只含有上游230bp的Iat基因区段及下游170bp的基因区段。本发明中步骤(I)和步骤(3)所述的载体较佳的是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒PGH112。步骤(2)所述的宿主细胞较佳的是大肠杆菌，更佳的是大肠杆菌ET12567。步骤(4)所述的受体较佳的是棒状链霉菌，更佳的是棒状链霉菌紫外诱变克拉维酸高产突变株。步骤(5)所述的受体较佳的是基因整合有安普抗性基因的棒状链霉菌突变菌株的原生质体。步骤(5)所述的棒状链霉菌的原生质体的较佳制备条件为采用lmg/mL的溶菌酶浓度，酶解45min。步骤(5)所述的棒状链霉菌的原生质体的较佳转化条件为采用25%的PEG1000介导转化，转化前将棒状链霉菌原生质体于45°C温育lOmin，以降低链霉菌的限制性酶的活性。相比于现有技术，本发明所具有的有益效果如下
本发明通过紫外线诱变及基因工程的手段提高棒状链霉菌的克拉维酸的产量，首先通过紫外诱变获得了产量为原始菌株1. 9倍的突变菌株，在以该突变菌株为出发菌株，通过同源重组交换来阻断其hi基因，最终构建的工程菌株的产酸量是原始菌株的2. 3倍。通过基因工程手段提高棒状链霉菌的克拉维酸产量的方案已经出现很多，本发明首次采用紫外线诱变及基因工程相结合的手段，并且采用PCR-targeting对棒状链霉菌的基因进行了突变，经本发明构建的工程菌，克拉维酸产量明显提高，产酸量较稳定，且不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造。
图1是出发菌株抑菌圈与突变株抑菌圈比较；图中372，373，374为紫外诱变突变株，B71为出发菌株；
图2是发酵液HPLC色谱图；克拉维酸的保留时间为3. 972分钟；
图3是51基因的PCR产物；M.1Okb Marker;1.棒状链霉菌赖氨酸ε -转氨酶基因的PCR产物；
图4是安普抗性框的引物设计；
图5是安普抗性框的PCR产物；1.阿泊拉抗性框的PCR产物；Μ.1OObp Marker。图 6 是重组质粒 pGH112 -1at 的验证；M.1Kb . Marker ；1. EcoRl、BamHl 双酶切pGH112 -1at 质粒；2.质粒 pGH112_7ai 的 PCR 产物；
图7是重组质粒pELA的构建过程示意图8是重组质粒pELA的PCR验证；M.1OObp Marker ； I, 2，3，4.质粒pELA的PCR产
物； 图9是重组质粒pSCAR的限制图谱；
图10是重组质粒pSCAR的酶切验证；1.历/ /ΙΠ酶切pELA ; 2.酶切pELA;
M.lkb Marker; 3.历·Ζ7 /III 酶切 pSCAR ; 4.酶切 pSCAR ;5· 酶切 pSCAR ;
图11是pELA与染色体的双交换示意图12是突变株的PCR验证；1.突变株51 clavuligerus lat::aac的PCR产物2.突变
IS. clavuligerus lat:: A 的 PCR 产物；Ml.1OObp Marker ； M2.1Okb Marker; 3.出发菌株 51 clavuIigerus^ll 的 PCR 产物；
图13是突变株和原始菌株头霉素C的抑菌圈；1为对照菌株的抑菌圈，2，3，4分别为三株突变菌株的抑菌圈；
图14为Iat基因PCR扩增后的核苷酸序列；
图15为安普抗性框PCR扩增后的核苷酸序列。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。实施例1
棒状链霉菌NRRL3585的紫外线诱变
菌种棒状链霉菌 NRRL3585 (5 clavuligerus NRRL3585)，菌种保藏号 CPCC 600044 ；肺炎克雷伯氏菌pneumoniae^ ATCC 29665,菌种保藏号 29665 。主要培养基及溶液ISP培养基ISP 8g、琼脂粉20g，调pH至7. 3 ；TSB液体培养基(L—1) TSB 30g、淀粉 10g、pH6. 8 7. O ; SS 液体培养基(L—1):黄豆粉 15g、淀粉 4. 7g、KH2PO4 O. lg、FeS04*7H20 O. 2g, pH6. 8。其他常规培养基及溶液均参考萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M]，第三版，北京科学出版社，2002。方法
孢子悬液的制备
(I)挑取于ISP固体培养基上培养好的5 clavuligerus的单菌落转接于YMGA斜面，28°C培养2 3d，用大接种环将孢子刮下转接于茄子瓶中的YMGA斜面，28°C培养5 7d。(2)向培养好的茄子瓶斜面中加入40mL无菌水。
(3)用无菌大接种环用力由轻到重将孢子刮下。(4)将刮下的菌体全部转入无菌三角瓶中(含玻璃珠)，剧烈振荡lmin。(5)将上述孢子悬液用装有无菌原棉的注射器过滤,所得滤液于IOOOg离心IOmin沉淀孢子。(6)弃上清，轻弹管壁使沉淀分散于残留在管壁上的液体中。(7)加入2mL 20%的无菌甘油，迅速混匀，保存于_20°C。(8)使用前光学显微镜观察，血球计数板计数，适当稀释使孢子浓度达到IO8个/mL。如暂时不使用，则加入20%甘油迅速混匀后_70°C冰箱保存。
紫外线诱变处理
(I)将培养好的5 clavuligerus孢子斜面制备孢子悬液。(2)吸取孢子悬液5mL于60mm的无菌平板中，紫外照射诱变采用15W或30W紫外线，提前预热20— 30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20— 30cm处进行紫外照射30—45秒。(3)取照射后的孢子悬液O.1mL涂布于含12%甘油的YMGA平板上，28°C避光培养7天。以上操作均在暗室进行。突变菌株的筛选1.琼脂块法初筛
(I)挑取含12%甘油平板上长出的单菌落，点接于不含甘油的YMGA平板上，28°C培养
2 4d。(2)在形成丰满的气生菌丝，但还未长出分生孢子之前，用6 8mm的无菌打孔器将每个菌落连同一定厚度的琼脂块一同取出，移至空的无菌平皿中。(3)保持湿度继续培养，使其在生长发育过程中合成的抗生素限制在琼脂块中。(4)当孢子生长成熟后再移至生物检定平板上，同时合理放置对照菌落，对照菌落的数量占总琼脂块的25%。(5)测定每个琼脂块的抑菌圈直径，挑取抑菌圈明显大于对照菌的菌落，转接至斜面，以备进一步复筛。2.摇瓶复筛
(I)用接种环从活化的斜面上挖取一菌环的s. clavuligerus菌丝体连同培养基接于装有5mL ISP培养基的50mL三角瓶中，于180r/min，28°C培养48h。(2)将上述培养物转接于装有50mL TSB培养基的250mL挡板三角瓶，于180r/min，28°C 培养 36h。(3)将培养好的种子液按5%的接种量接入发酵瓶中，500mL挡板三角瓶装液量为50mL，180r/min，28°C，培养时间为 72 120h。(4)取不同发酵液于EP管中，13200r/min离心IOmin,上清液经O. 45 μ m滤膜过滤，测定其克拉维酸含量。克拉维酸的测定(I)色谱条件
日本岛津高效液相色谱仪LC-10AT泵，SCL-10A控制系统；
色谱柱Shim_pack VP-ODS (150X4.6), Shim-pack GVP (4. 6mm)保护柱；流动相磷酸二氢钾(O. 1Μ)-6%甲醇溶液，磷酸调pH值至3. 2，使用前经微孔滤膜(O. 45 μ m)过滤；
体积流速1. 5mL/min ；
检测波长312nm ；
进样量10yL;
柱温室温； 检测器sro - MlOAE 二级管阵列；
Class-VP色谱工作站。(2)测定方法
X工作曲线的绘制精密吸取不同稀释度的克拉维酸标样与咪唑溶液按1:5的比例混匀，30°C反应12min，迅速冷却至20°C，制得衍生标样。精密量取各衍生标样ΙΟμ 进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。②发酵液的测定将处理后发酵样品按标准曲线的绘制中的方法进行衍生，精密量取IOPL进样，测定克拉维酸含量。棒状链霉菌的发酵培养
将棒状链霉菌在ISP固体平板上划线分离，28°C培养3-5d后，挑取单菌落接种到5mL液体ISP培养基中，200r/min，28°C培养24h，按1% (v/v)接种量转接至液体TSB种子培养中，采用250mL挡板三角瓶，装液量25mL/瓶，28°C，150r/min培养24h，按10% (v/v)接种量转接至SS发酵培养基进行培养，采用500mL挡板三角瓶，装液量为50mL/瓶，发酵条件为28°C，150r/min,发酵至 72h，96h 及 120h 时取样，样品经 13200r/min 离心 IOmin，上清液作为检测样品。棒状链霉菌突变株B372的遗传稳定性考察
将棒状链霉菌突变株B372进行连续四次转接传代，摇瓶发酵后HPLC法测定克拉维酸的效价。结果紫外诱变突变株的初筛结果见表I和图1。表I初师统计结果
突变铢抑菌圖直径出发菖律抑菌HSS綱< I 001.0CM. 50151-2M>.100突变铢數目_+:56641510910所占胃分比IlH雜P#U
由表I可以看出，在含12%甘油的YMGA平板中生长的突变株中，绝大部分突变株的产量均不同程度上高于出发菌株，仅有11%为负突变。有20%的突变株的产量较出发菌株提高了 50%以上，其中有10株的产量较出发菌株提高了 I倍，占1. 7%。说明以甘油作为选择压力能够有效的提高正突变株的筛选率。从比出发菌株提高50%以上的甘油耐受性突变株中选取37株进行斜面培养，准备摇瓶复筛。摇瓶复筛结果将初筛所得的甘油耐受性突变株分别转接于5mL ISP中，180r/min，28°C培养48h，HPLC法测定其克拉维酸含量，结果见图2。发现有一株甘油耐受性突变株其发酵液中克拉维酸的效价比出发菌株提高了 80 %以上。棒状链霉菌突变株B372的遗传稳定性考察结果见表2，由表2可知，突变株B732在传代4次之内产酸量及其甘油耐受量较稳定，继续传代，则菌种的产酸量及其甘油耐受量均明显下降，所以应尽量控制传代次数在4代以内。表2 51. clavuligerus B732 的遗传稳定性
权利要求
1.棒状链霉菌突变株Iat: : Δ (Streptomyces clavuligerus Iat: : Δ )菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC No。
2.权利要求1所述的菌株，其中棒状链霉菌突变株Iat△{Streptomyces clavuligerus Iat:: Δ)是由野生菌株Sire/ clavuligerus NRRL3585突变而来， 其是由所述野生菌株经紫外线诱变及基因工程改造筛选得到的克拉维酸高产的突变株。
3.权利要求1或2所述棒状链霉菌突变株Iat:: Δ {Streptomyces clavuligerus Iat:: Δ)菌株在制备用于提高抑制耐药细菌产生β —内酰胺酶的活性增强抗生素广谱抗菌药物中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中所述的提高抑制耐药细菌产生β—内酰胺酶的活性指的是提高克拉维酸产量抑制β —内酰胺酶活性。
5.一种紫外线诱变选育高产棒状链霉菌突变株Β372clavuligerus B372)菌株的方法，其特征在于包括如下步骤(O棒状链霉菌孢子悬液的制备；(2)紫外线诱变；(3)初筛通过琼脂块法对高产克拉维酸的棒状链霉菌进行初筛；(4)复筛用摇瓶发酵，HPLC法检测发酵液克拉维酸量的多少来进行复筛；(5)验证高产菌株将复筛后得到的高产菌株传代培养6次，每次都用与复筛一样的方法对菌株产酸稳定性进行验证。
6.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于紫外照射诱变采用15W或30W 紫外线，提前预热20— 30分钟后，将孢子悬液置于距离紫外线20— 30cm处进行紫外照射 30—45 秒。
7.根据权利要求5所述的诱变育种方法，其特征在于按以下的步骤进行Cl)构建基因中插入安普抗性框的重组质粒pELA ；(2)将含有Iat基因的重组质粒pELA转化宿主细胞，获得转化子；(3)构建基因内部被敲除的重组质粒pSCAR；(4)将棒状链霉菌B372作为受体，与步骤2)所述的转化子进行接合转移，获得接合子，即棒状链霉菌的Iat基因阻断突变菌51 c la vu Iigerus I at: :aac ；(5)将棒状链霉菌5 cla vu Iigerus I at: :aac作为受体，将步骤3)所述的重组质粒P SCAR转入受体菌，获得不含有任何抗性标记的7a 基因敲除的突变菌株S.cla vuIigerus I at: : Δ。
8.根据权利要求7所述的诱变育种方法，其特征在于，所述的棒状链霉菌突变株B372 的hi基因的第191 1600位之间的核苷酸片段被一段安普抗性基因置换掉，不含有任何抗性标记的Iat基因敲除的突变菌株。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(I)和(3)所述的重组载体的载体骨架是质粒大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒PGHl 12 ;步骤(2)所述的宿主细胞是大肠杆菌ET12567。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤(5)所述的受体是棒状链霉菌 lat: :aac的原生质体,原生质体的制备条件为采用lmg/mL的溶菌酶浓度,酶解45min,原生质体的转化条件为采用25%的PEG1000介导转化，转化前将棒状链霉菌原生质体于45°C温育lOmin，以降低链霉菌的限制性酶的活性。
全文摘要
本发明公开了一种棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)的工程菌株及其制备方法与应用。该棒状链霉菌首先通过紫外诱变技术获得了克拉维酸产量为原始菌株1.9倍的突变株B372，再以该突变株为出发菌株采用PCR-TARGETING构建了lat基因敲除的突变菌S.clavuligeruslat::Δ，发现经紫外诱变及lat基因敲除后，棒状链霉菌的克拉维酸的产量获得了较大的提高，为原始菌株的2.3倍。本发明所构建的工程菌，克拉维酸产量明显提高，不含有任何抗性标记，很方便用于进一步的基因工程改造；通过连续传代，克拉维酸产量比较稳定，重复性好。
文档编号C12N15/09GK103013865SQ20121051214
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月4日 优先权日2012年12月4日
发明者左志晗 申请人:天津师范大学